糖耐量损害大鼠脑组织NF－κBp65及TNF－α表达水平与认知障碍的关系

魏 佳 董银华 赵 岚 王洪新

随着人们生活水平提高，饮食结构改变，越来越多糖尿病患者出现，糖尿病成为众多专家学者关注的焦点。糖尿病中枢神经系统并发症成为人们近年研究的新领域，其中认知障碍是糖尿病中枢神经系统并发症的重要表现之一［1，2］。糖耐量损害是介于正常血糖与糖尿病之间的一种代谢异常状态，糖耐量损害是否与认知障碍有关，尚无明确报道。本研究通过建立糖耐量损害大鼠模型，从炎症机制角度探讨糖耐量损害与认知障碍的关系，为糖耐量损害的认知障碍的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备 SPF级wistar雄性大鼠60只，体重180～200 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK－（军）2007－004，随机分为对照组和实验组，每组各30只。适应性喂养1周（不计入实验周期），对照组给予普通饲料，实验组给予高脂高糖饲料，自由进水，室温18～22℃，饲养20周。从第8周开始，以后每2周进行1次葡萄糖耐量实验，测鼠尾血糖。空腹血糖6.2～7.5 mmol／L 或者餐后2 h血糖7.9～10.4mmol／l的大鼠提示造模成功［3］。

1.2 行为学检测 对照组和实验组分别于第5、10、15、20周采用自制简易水迷宫试验测定大鼠学习记忆能力，包括适应性训练、定位航行训练、空间探索试验三部分。

1.3 大鼠脑组织石蜡切片 实验组和对照组大鼠分别于第5、10、15、20周末采用断颈取脑法，脑组织做石蜡切片。

1.4 免疫组化法检测大鼠脑组织中NF－κBp65及TNF－α因子的表达水平 选用武汉博士德公司的免疫组化试剂盒检测NF－κBp65及TNF－α的表达水平，空白对照以0.01 mol／L PBS代替一抗。操作步骤严格按说明书进行。每张切片在显微镜200倍视野下选5个互不重叠视野，以平均光密度值反映表达水平。

1.5 统计学处理

水迷宫试验数据采用SPSS20.0软件，根据重复测量的多因方差分析对数据进行分析，数据以±s表示，组间均数比较采用q检验。对大鼠脑组织 NF－κBp65、TNF－α阳性表达水平与认知障碍进行Pearson相关分析。P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 糖耐量损害大鼠成模情况

高脂高糖饲料饲养10周大鼠成模率60%，饲养15周大鼠成模率100%。

2.2 自制水迷宫实验

由表1和表2可知，第5周实验组较对照组逃避潜伏期短，空间探索时间长，随着饲养周期的延长，糖耐量损害大鼠逐渐成模，第15周实验组大鼠全部成模，实验组大鼠较对照组大鼠逃避潜伏期延长，空间探索时间缩短 （P＜0.05）；第20周时实验组学习记忆能力显著下降（P＜0.01）。

表1 大鼠定位航行实验的逃避潜伏期（±s，n＝5，s）

表1 大鼠定位航行实验的逃避潜伏期（±s，n＝5，s）

注：与同时间点对照组比较，＊P＜0.05，△P＞0.05，▲P＜0.01

组别 逃避潜伏期第1 d 第2 d 第3 d 第4 d 21实验组 12.79±0.11＊ 5.21±1.1＊ 2.78±0.29＊ 2.1±0.07＊第10周对照组 15.69±0.28 5.35±0.72 3.41±0.27 2.96±0.17实验组 22.55±0.54△ 5.65±0.16△ 3.90±1.70△ 2.85±0.32△第15周对照组 20.55±1.98 10.34±1.07 5.22±0.87 2.9±1.10实验组 32.73±5.73＊11.75±1.90＊ 6.73±0.24＊ 4.53±0.34＊第20周对照组 20.12±3.85 12.38±2.74 5.43±0.92 3.01±0.98实验组 68.23±5.66▲45.98±12.81▲ 14.03±2.79▲ 5.63±0.76第5周对照组 14.89±0.56 6.37±0.33 3.25±2.83 2.99±0.▲

表2 大鼠空间探索试验2 min内大鼠穿过平台所在象限的时间（s）

2.3 大鼠脑组织 NF－κBp65、TNF－α表达水平

NF－κBp65、TNF－α阳性表达为胞浆呈现棕黄色，强阳性时细胞核也出现棕黄色颗粒，胞核蓝染。采用平均灰度值比较大鼠脑组织 NF－κBp65和TNF－α蛋白阳性表达水平。在第5周和第10周实验组与对照组差异不明显（P＞0.05），第15周实验组与对照组有明显差异（P＜0.05），第20周实验组与对照组有显著差异（P＜0.01）（图1、2）。

图1 空白对照（左）、对照组（中）与实验组（右）大鼠大脑皮质NF－κBp65蛋白阳性表达水平（DAB染色×200倍）

图2 空白对照（左）、对照组（中）与实验组（右）大鼠大脑皮质TNF－α蛋白阳性表达水平（DAB染色×200倍）

2.4 NF－κBp65及 TNF－α的表达水平与认知功能之间的关系

Pearson直线相关回归分析显示，实验组大鼠学习记忆成绩与NF－κBp65阳性表达水平呈正相关（r＝0.972，P＜0.05），与 TNF－α阳性表达水平呈正相关（r＝0.975，P＜0.05），而对照组两者无明显相关性（r＝0.260，P＞0.05）。

3 讨 论

糖耐量损害（IGT）是介于正常血糖与糖尿病之间的异常糖代谢状态，不仅是糖尿病的高危人群，而且也较多地聚集了心、脑血管疾病的危险因素。英国前瞻性糖尿病研究发现，新诊断的2型糖尿病半数已有血管病变，提示血管病变可发生于糖尿病之前，即在IGT阶段已经有炎性反应的发生，且可能与血管性认知障碍有关［4］。近年研究发现较多的炎性因子在胰岛素抵抗和IGR的发生中具有重要作用，如C反应蛋白 、肿瘤坏死因子－a等都与糖耐量损害有关［5］。

NF－κB是一种广泛的核转录因子，在静息状态下以二聚体状态在细胞浆内与Ik B结合，激活后与IkB解离，NF－k B核因子定位序列暴露，NF－κB进入细胞核内，以二聚体的形式起转录调节作用，从而诱导白细胞介素－1、细胞间粘附分子、肿瘤坏死因子（TNF－α）等的表达，白细胞在各种炎性介质的介导下向血管内皮细胞移动、粘附并渗出，参与炎症的的级联反应，最终导致缺血性神经元的损伤。另外，各项因子如肿瘤坏死因子、白介素的表达反过来进一步增加NF－κB表达，从而进一步促进炎症因子的表达，进一步加重炎症反应，形成恶性循环［6～8］。

综上所述，本研究通过观察糖耐量损害大鼠脑组织NF－κBp65及TNF－α的阳性表达水平与大鼠学习记忆能力减退的关系，为糖耐量损害导致认知障碍的炎症机制提供了理论依据，为血管性认知障碍的治疗提供新的靶点。

1 孙海鸥，殷玉华，姬秋和，等.糖尿病脑病.国外医学（内分泌学分册），2004，24（2）：79－81.

2 Daniel J，Boris P，Linda A，et al.Relationships between hyper glycemia and cognitive performance among adults with type 1 and type 2 diabetes.Diabetes Care，2005，28（1）：71－77.

3 王 竹，杨月欣，向雪松，等.实验大鼠血糖正常范围的估算.卫生研究，2010，39（2）：133－137，142.

4 Debeng D，Amelang M，Hasselbach P，et al.Diabetes and cognitive function in a population－based study of elderly women and men.J Diabetes Complications，2006，20（4）：238－245.

5 Griffin WS.Inflammation and neurodegenerative disease.Am J Clin Nutr，2006，83（suppl）：470－474.

6 Cora H.Nijboer，Cobi J，et al.A dual role of the NF－kappa B pathway in neonatal hypoxic－ischemic brain damage.Stroke，2008，39（9）：2578－2586.

7 Kaltschmidt B，Kaltschmidt C.NF－κB in the Nervous System.Cold Spring Harb Perspect Biol，2010，2（1）：a001271.

8 Kaltschmidt B，Ndiaye D，Korte M，et al.NF－kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A／CREB signaling.Mol Cell Biol，2006，26（8）：2936－46.