BS69细胞原核表达载体的构建和诱导表达*

陈晓娟 张颜波 闫少春 邵 国

(1.包头医学院生物研究中心和基础医学院，内蒙古 包头 014060；2.泰山医学院附属医院神经内科，山东 泰安 271000)

BS69是一个多结构域的蛋白，也称之为ZMYND11(zinc finger，MYND domain containing 11)，它的氨基端含有Bromo结构、PWWP结构和PHD锌指，而羧基端则含有一个MYND锌指。研究显示：BS69还存在一个不同的剪切本—BRAM1，它只是包括羧基端的一个部分[1]。

对BS69研究较多的是其对EB病毒(一种转化的DNA病毒，主要感染人的鼻炎上皮细胞和B淋巴细胞)LMP1蛋白的调控[2]。在全世界的总人口当中，大约95%的人群呈现EBV阳性，但由于人体其本身免疫系统的保护，这些人群大部分还是健康的。但是，如若某些免疫系统功能下降，EBV即可能与鼻咽癌、Burkitt淋巴癌、Hodgkin疾病的发生发展有关[3]。其次，EBV也很容易转化为人静止的B细胞，从而形成永生的淋巴细胞系。

此外，有证据表明：BS69能通过MYND结构域，结合转录辅抑制因子N-CoR，来发挥其转录抑制的作用，从而抑制它的转录活性[4]；而BS69除了可以与一系列的转录因子发生相互作用之外，与调节染色质结构的蛋白-诸如染色质重构复合物中的Brg1[5]蛋白、组蛋白甲基转移酶EZH2、组蛋白去乙酰酶HDAC1等也可以发生相互作用[6]。因此，运用纯生物化学的方法，在体外对BS69细胞进行原核表达，对于其在体外功能的研究是有长远意义的。所以，本次研究，我们将大肠杆菌作为生物反应器，对BS69进行表达，为研究此生物的体外特征以及其生物学功能做好铺垫。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

pEGFP-BS69质粒由Dr.Jun Wan赠予[7]；Expand High Fidelity PCR System 及rapid ligation Kit 购于Roche公司；DNA凝胶回收试剂盒于Qiagen公司； Thrombin 购于Novus 公司；限制性内切酶EcoRI 和BamHI 购于Takara 公司；DNA 回收试剂盒购于Qiagen 公司，GSTrap HP 购于GE 公司。

1.2 方法

1.2.1BS69基因的亚克隆 取1 μl由Dr.Jun Wan赠予pEGFP-BS69质粒作为模板，按照Expand High Fidelity PCR System方法进行PCR扩增，所用引物为：F:5'- CGGGATCCATGGCACGTTTAACAAAAAGA-3';R:5'-GCGAATTCTCATTGGTGATGGTGATGATGTCTTTTCCGGCGGCAGGTGCG-3'。扩增条件为94 ℃ 变性5 min; 94 ℃、30 s;56 ℃、60 s；72 ℃、300 s;共进行30个循环，72 ℃延伸8 min。1.0% 琼脂糖凝胶电泳对PCR 产物进行电泳，将1.7 kb的扩增产物用Qiagen 公司的DNA凝胶回收试剂盒进行回收。

1.2.2原核表达载体的构建和鉴定 将回收的1689bp的片段及PGEX-4T·3载体分别用EcoRI和BamHI双酶切后回收所需要的目的片段，之后将回收的片段及质粒用rapid ligation kit连接酶进行连接。连接后生成的连接产物再转化入DH5α感受态细菌，加入LB培养液，取少量菌液进行涂平板，次日挑取单个克隆进行扩增、摇菌、并提取质粒。之后将提取的重组质粒分别用BamHIⅠ和EcoRⅠ进行双酶切。将酶切正确的重组质粒测序并鉴定。

1.2.3PGEX-4T·3-BS69质粒在大肠杆菌中的表达 将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21中，使其筛选阳性表达菌株，并接种于选择性LB液体培养基中( 50 g/ml amp )，37 ℃ ，225 r/m in，振荡培养至OD600=0.7时，加入IPTG 1 mol /L于菌液中，此时IPTG的终浓度为0.5 mmol/L，诱导5 h后，收获菌体；同时设空质粒的对照组。

1.2.4蛋白纯化 将按上述方法诱导培养后收集的菌体，加入5 倍体积冰冷的PBS清洗3遍，然后再用1 ml冰冷的PBS对菌体进行悬浮；之后在冰浴上用超声破碎仪破菌99次，间歇5 s，每次4 s，电压为200V～300 V，13000 rpm，4 ℃，离心机离心20 min，将上清液移入另一支干净的离心管中。之后上清液按照 GSTrap 说明书进行蛋白纯化，经Thrombin 酶切洗脱下来的蛋白跑SDS-PAGE胶电泳进行鉴定。

2 结 果

2.1 PCR扩增目的片段

通过PCR进行扩增，将产物进行1﹪琼脂糖凝胶电泳，将得到1689bp左右的目的片段回收。

2.2 重组表达载体PGEX-4T·3-BS69的构建及酶切鉴定

将PCR 产物及PGEX-4T·3以EcoRI和Bam HⅠ双酶切，酶切产物经PCR 纯化试剂盒纯化去除小片段，经rapid ligation Kit进行连接，连接产物转化入感受态细菌中。挑取单克隆，进行扩大培养，提取质粒，经Bam HⅠ和EcoRI双酶切，1﹪琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，表明目的片段已插入到表达载体中，电泳结果见图1。

M：marker；1：pGEX-BS69质粒BamHI和EcoRI酶切，切出1.7kb和4.3kb两个片段

2.3 PGEX-4T·3-BS69序列测定

选取其中6个克隆送公司进行测序，测得序列与Genbank登记的大鼠的BS69基因同源序列完全相同即为大鼠的PGEX-4T·3-BS69质粒。

2.4 BS69蛋白纯化

含有PGEX-4T·3-BS69的BL21经IPTG诱导表达后，分离上清中含有GST-BS69融合蛋白，融合蛋白与GSTrap结合后利用Thrombin 酶切将BS69释放出来，经SDS-PAGE分析( 图2),可明显看到预期BS69分子量大小相符( 约70kD ) 的条带。

M：marker；BS69：纯化的BS69蛋白

3 讨 论

BS69最初由Hateboer等人鉴定出来，并因为其分子量为69kda而进行命名。他们还用Northern杂交的方法，分析小鼠几种不同组织中BS69的表达水平，并在所有的测试组织中发现一个转录本，大约有4.7kb,且检测其在睾丸、脑、肺中表达量较低，而在肾脏中的表达量最高。同时还发现BS69作为一种腺病毒结合蛋白，它的主要功能是通过289R EIA肿瘤蛋白抑制反式激活，在与各种转录因子的相互联系中充当协阻抑物的角色，从而抑制EIA的反式活化作用和转录促进作用[8,9]。但是迄今为止，BS69的很多特点和确切的生物学功能仍有待于研究。

除此之外，BS69还可能参与细胞的衰老[10]。例如在人的原代成纤维细胞IMR90中，使用RNA干扰的方法使BS69的表达降低时，发现细胞的扩增速度变得很慢，这一现象说明BS69可能参与了细胞周期的调控[11]；与此用时，研究者还发现BS69作为一种转录调控的阻遏因子，可能也会通过抑制细胞周期相关基因的表达来发挥其功能；因此，经过进一步的分析发现，p21Cip1在敲除BS69之后表达量会增高，p21作为一种细胞周期的抑制因子，在衰老细胞的表达中被诱导性升高，但是p53和p16等基因的表达却没有什么改变。因此，BS69是否与细胞的衰老有联系也有待于研究。

我们成功构建了原核表达载体PGEX-4T·3-BS69，并对其进行了体外表达，为进一步研究BS69的功能奠定了基础。

本研究为BS69蛋白功能的研究，和深入探讨EB病毒诱导的信号转导机制奠定基础,并以期对揭开病毒复制和对细胞产生的影响，设计药物阻止病毒复制、EBV 及相关肿瘤的预防和治疗提供一些新的线索。

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[9] G Hateboer, A Gennissen, YF Ramos, et al.BS69, a novel adenovirus E1A- associated protein that inhibits E1A transactivation[J].EMBO J,1995,(14): 3159-3169.

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