HPLC测定不同厂家六味地黄丸中丹皮酚的含量*

宋 晓 孙晓慧 李 珂

(泰山医学院药学院，山东 泰安 271016)

六味地黄丸的成分由熟地黄、山茱萸(制)、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻组成。因由六位中药材组成，其中熟地黄为君药，故名，是滋补肾阴的基础方剂[1]。牡丹皮具有良好的清热、止血、活血、消瘀等功能，丹皮酚是牡丹皮的重要有效成分[2]。目前，丹皮酚的含量测定有高效液相色谱法、分光光度法、气相色谱法、薄层扫描法、胶束毛细管电泳法等。

本次试验应用高效液相色谱法对丹皮酚含量进行测定[3]，2010年版药典对六味地黄丸及六味地黄丸(浓缩丸)中牡丹皮的控制也是采用HPLC法测定丹皮酚的含量，但同时对比控制九个厂家的丹皮酚的含量尚属首次。本法分离效率高，灵敏度好，能较好地测定不同厂家的六味地黄丸中丹皮酚的含量，从而为厂家优化处方含量以及患者选药提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 岛津高效液相色谱仪(岛津国际贸易有限公司)、不锈钢过滤器(DP-01)溶剂过滤器加真空(DP-01 VACOOM PRESSURE PUMP)、KQ-500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)、微孔滤膜(上海市新亚净化器件厂)。

1.2试药 丹皮酚对照品(中国药品生物制品检定所，批号110708-200505)；天福康六味地黄丸(1号)浓缩丸(批号：20110919，马鞍山神鹿科瑞药业有限公司)；同仁堂六味地黄丸(2号)水蜜丸(批号：1035608，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂)；修正六味地黄丸(3号) 浓缩丸(批号：111102，通药制药集团股份有限公司)；太极六味地黄丸(4号) 浓缩丸(批号：1112222，太极集团重庆制药二厂有限公司)；九芝堂六味地黄丸(5号)浓缩丸(批号：201109060，九芝堂股份有限公司)；仁和六味地黄丸(6号) 浓缩丸(批号：110507，江西药都樟树制药有限公司)；华佗六味地黄丸(7号) 浓缩丸(批号：20110305，安徽华佗国药股份有限公司)；仲景六味地黄丸(8号) 浓缩丸(批号：110640，河南省宛西制药股份有限公司)；孙真人六味地黄丸(9号) 浓缩丸(批号：20111031，河南省济源市济世药业有限公司)。

2 实验方法与结果

2.1色谱条件

2.1.1色谱条件的选择 色谱柱：Diamonsil C18柱(250 nm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(70∶30)，流速：1.0 ml/min；检测波长：274 nm；柱温：20℃。进样量：20 μl。取空白溶剂甲醇、丹皮酚对照品和六味地黄丸样品溶液各20 μl进样，记录色谱图(图1)。结果丹皮酚与样品中其他成分达到基线分离，分离度为1.59，理论塔板数大于2000。

2.1.2紫外吸收波长的选择 对丹皮酚标准品溶液进行紫外光谱扫描，丹皮酚的紫外吸收光谱如图所示(图2)，最大吸收波长为274 nm，选择274 nm作为检测波长。

2.2溶液的制备

2.2.1丹皮酚对照品溶液 精密称取丹皮酚对照品适量，加甲醇溶解并定容，配置成100 μg/ml的丹皮酚储备液。精密量取丹皮酚储备液0.02，0.08，0.24，0.4，0.6，1.5 ml分别置于5 ml棕色容量瓶中，用甲醇稀释并定容，得浓度分别为0.4，1.6，4.8，8.0，12，30 μg/ml的丹皮酚对照品溶液。

2.2.2六味地黄丸样品溶液 取六味地黄丸研细，精密称取0.5 g于50 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度。超声20 min，放至室温，摇匀，高速离心5 min，5000 r/min，上清液即为六味地黄丸样品溶液。

2.3方法学考察和样品测定

2.3.1标准曲线的绘制 分别取不同浓度的丹皮酚对照品溶液进样20 μl，以丹皮酚峰面积(A)对丹皮酚浓度(C)进行回归处理，得到标准曲线回归方程为A=123549C+75111，r=0.9997。表明丹皮酚在0.4～30 μg/ml范围内浓度与峰面积线性关系良好。

2.3.2稳定性试验 取常温避光条件下放置的六味地黄丸样品溶液20 μl，按照上述色谱条件分别在0，1，3，5，8，10，24 h进样，测定丹皮酚的峰面积，RSD=2.20% ，结果表明供试品在24小时内常温避光条件下基本稳定。

2.3.3精密度试验 取同一厂家的六味地黄丸供试品溶液20 μl，连续重复进样6次，测定其日内精密度。结果重复进样平均峰面积711294.7，RSD=1.04%，表明进样样品精密度良好。

2.3.4重复性试验 称取同一厂家的六味地黄丸供试品6份各0.1 g，置于25 ml容量瓶中，加甲醇定容，超声20 min，摇匀后离心5 min，5000 r/min，分别取上清液20 μl进样测定。结果6份样品中丹皮酚的平均含量为1.24 mg/g，RSD为1.61%。表明本方法的重复性良好。

图1 甲醇(A)、丹皮酚对照品(B)和六味地黄丸样品(C)的色谱图

图2 丹皮酚紫外吸收光谱图

2.3.5加样回收率试验 精密称取同一厂家(1号)的六味地黄丸样品粉末9份，编号1-9，分别置于5 ml棕色容量瓶，1,2,3为一组，分别加入0.7 ml丹皮酚储备液；4,5,6为一组，分别加入0.8 ml丹皮酚储备液；7,8,9为一组，分别加入0.9 ml丹皮酚储备液，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。超声取上清液20 μl进样测定，结果见表1。

2.3.6样品含量测定 分别取9个厂家六味地黄丸各三份，制备样品溶液，分别进样20 μl，每个样品进样3次，记录色谱图。测定结果见表2。

表1 丹皮酚加样回收率测定

表2 样品含量测定结果

3 讨 论

3.1检测波长的选择 对丹皮酚标准品进行紫外光谱扫描，丹皮酚最大吸收波长为274 nm，与文献一致[4]，最终选用274 nm作为检测波长。

3.2超声提取时间的选择 甲醇超声提取丹皮酚的时间，分别进行了10 min，20 min，30 min，40 min的超声提取实验[5]，进样测定丹皮酚含量，发现20 min，30 min和40 min提取量相近多于10 min的提取量，最终选择20 min为实验超声提取时间。

3.3含量比较 在本实验中建立的HPLC法简便、快速、重复性高、精密度好，可以用于测定六味地黄丸中丹皮酚含量。根据本次实验结果，实验中测量的9个厂家的六味地黄丸中，除1号低于2010年版药典每1 g含牡丹皮以丹皮酚计不得少于1.8 mg外，其余六味地黄丸(浓缩丸)中丹皮酚含量都符合规定；同仁堂(水蜜丸)中的丹皮酚含量也符合每克以丹皮酚计不得少于0.9 mg的规定；但九个厂家的丹皮酚相对含量仍有差别。

[1] 张叶,吴剑,李端,等.超微电极快速扫描法检测六味地黄丸中的丹皮酚[J].辽宁化工,2011,40(8):884-885.

[2] 李珂,贾宝秀,刘彩红.高效液相色谱法测定加味逍遥丸中丹皮酚的含量[J].医药导报,2010,29(10):1345-1355.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010：597-599.

[4] 李珂,齐永秀,李玉琴,等.HPLC法测定徐长卿中丹皮酚的含量[J].泰山医学院学报,2010,31(11)：856-858

[5] 徐飞,尹蓉莉,钟玲,等.超声提取六味地黄丸复方的工艺研究[J].时珍国医国药,2006,17(8):1432-1434.