液相串联质谱法检测糖尿病患者血浆25-羟基维生素D3*

郭守东 崔华东,2 桑 慧 李 煜 李富裕 展珊珊 张 颖 秦树存

(1.山东省高校动脉粥样硬化重点实验室，山东 泰安 271000；2.阿尔巴尼药学与健康科学学院，美国)

维生素D(vitamin D, VitD)于1922年被发现并命名，其可由食物中摄取，也可由皮肤中的7-脱氢胆固醇经紫外线照射异构而成。1968年，有学者提出维生素D3本身并无生物活性，必须经过代谢激活才能发挥生物效应。研究发现，维生素D3首先经肝细胞线粒体内的羟化酶羟化形成25(OH)D3，这是维生素D3在血液循环中的主要形式，25(OH)D3仍无生物活性，必须经肾小管细胞内羟化酶作用，最终转化成其生物活性形式1,25-(OH)2D3。1,25-(OH)2D3与维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)结合形成激素-受体复合物，再与细胞核的维生素D反应元件相结合，激活或抑制含有维生素D反应元件的基因，通过基因调节的方式发挥作用[1-4]；1,25-(OH)2D3还可通过非基因途径，如蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)信号途径来参与细胞的生长分化[5]。VitD的检测方法有竞争性蛋白结合法、液相色谱法、ELISA法和液相色谱-质谱仪法等[6-7]。本研究探讨目前公认的液相串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)检测血浆样本中的VitD，并将该法应用于正常人和糖尿病患者血浆中VitD的检测。

1 材料与方法

1.1材料 内标25(OH)D3-(26,26,26,27,27,27-d6)购于美国Medical Isotopes, INS公司。25(OH)D2、25(OH)D3、4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione (PTAD)、甲基叔丁基醚(tert-butyl methyl ether, t-BME)、乙腈、甲醇、甲酸和甲酸铵购于Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司。Oasis HLB萃取小柱购于Waters公司。去离子水由Millipore 纯水机获取。本研究的化学试剂为分析纯。人血浆样本由泰山医学院附属医院检验科提供。

1.2样本处理 健康人及糖尿病患者血浆样本采集于空腹12 h之后的早餐前，抗凝血液经1000 r/min离心15 min获得血浆。将500 μl甲醇/乙腈(80/20, v/v)和终浓度为100 ng/ml的内标25(OH)D3-d6加入500 μl血浆中，涡旋震荡5 min，12000 r/min离心10 min；取上清液800 μl加入300 μl Na2HPO4(0.4 mol/L)和750 μl t-BME，涡旋震荡5 min，12000 r/min离心10 min；上清液采用N2吹干，加入120 μl溶于乙腈的PTAD(0.75 mg/mL)，室温下孵育90 min；向孵育液中加入50 μl 含有0.1%甲酸的醋酸铵(4 mmol/L)；衍生物行Oasis HLB小柱进行洗脱：2.0 ml 30%乙腈、0.5 ml 70%乙腈和1.0 ml 100%乙腈；最终所得洗脱液采用N2吹干，重溶于0.2 ml 95%乙腈，备LC-MS/MS分析。

1.3标准曲线的制作 用乙醇配制100 μg/ml的25(OH)D2、25(OH)D3和内标25(OH)D3-d6储备液，分装后于-20 °C保存。将储备液采用甲醇稀释成制作标准曲线的工作液。

1.4LC-MS/MS分析 LC-MS/MS由岛津HPLC(LC-20AD、DGU-20A3脱气机和SIL-20AC自动进样器)，AB SCIEX公司的串联质谱(4000 QTRAP)和毕克(PEAK)牌氮气发生器(ABN2ZA)组成。 本研究采用的色谱柱为Waters C18分析柱(Waters Symmetry, 3.5 μm, 2.1 mm i.d.×100 mm)，同时配备Waters保护柱(3.5μm, 2.1 mm i.d.×10 mm)；采用线性洗脱，流动相为含有4 mM甲酸铵和0.1%甲酸的90%的甲醇溶液。进样体积为15.0 μl, 流动相流速为0.4 ml/min[8-9]。质谱采用电喷雾离子源(ESI)在正离子模式下采用多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)模式进行。离子喷雾电压(ion-spray voltage)和温度分别设定为5500 V和450℃。雾化气、辅助气和气帘气分别设定为55、55和10 psi，其中碰撞气设置为中等(Medium)。维生素D的质谱条件详见结果部分阐释；数据分析采用AB SCIEX分析软件V1.6。

1.5统计学分析 采用SPSS17.0进行统计学分析。数据以平均值±标准差的形式表示，组间比较采用t检验，P≤0.05则具有统计学意义。

2 结 果

本研究采用PTAD对VitD进行衍生，如图1所示。质谱图均在正离子模式下完成，优化后的定量分析条件及保留时间如表1所示。选择母离子的丰度为最强离子碎片丰度的1/3时的碰撞能量作为最佳碰撞能量，在该条件下的二级质谱图及典型的色谱峰如图2所示。25(OH)-D2、25(OH)-D3、25(OH)-D2的PTAD衍生产物[25(OH)-D2-PTAD]和25(OH)-D3的PTAD衍生产物[25(OH)-D3-PTAD]定量限(limit of quantification, LOQ)，定义为信噪比等于10(S/N=10)，依次为0.2、0.3、0.05和0.07 ng。

于VitD的PTAD衍生产物的定量限高于VitD，故本研究中采用PTAD衍生法测定血浆样本中的VitD含量。25(OH)-D2-PTAD和25(OH)-D3-PTAD的线性范围分别为0.1～25 和0.15～25 ng。25(OH)-D2-PTAD和25(OH)-D3-PTAD在上述线性范围内的回归方程分别为 y=782.77x-70.515 (R2=0.9977)和y=2345.7x+849.37 (R2=0.9971)。

本研究中采用PTAD衍生法测定的15例II型糖尿病患者血浆中25(OH)-D3平均值为(12.1 ± 3.9) ng/ml，18例健康人血浆中25(OH)-D3平均值为(20.8 ± 4.8) ng/ml；糖尿病患者血浆中25(OH)-D3的水平显著低于健康人平均值(P<0.05)。

表1 采用LC-MS/MS 法在MRM监测模式下定量VitD的参数设置

图1 采用PTAD衍生VitD的化学反应式及衍生产物的二级质谱裂解示意图[以25(OH)D3为例]

图2 VitD及其PTAD衍生产物在MRM模式下的典型色谱峰和二级质谱碎片

图3 采用PTAD衍生法所得VitD标准曲线

3 讨 论

VitD活性形式“1,25-(OH)2D3”的检查需采用更高灵敏度的LC-MS/MS进行；已有研究表明，25(OH)D3的水平与1,25-(OH)2D3的水平呈正相关，临床上现已采用25(OH)D3的水平间接反映其活性形式“1,25-(OH)2D3”的水平。本研究采用直接检查法和经PTAD柱前衍生的比对研究发现，PTAD柱前衍生25(OH)D3较直接检测法定量限提高了3倍，故本研究中均采用PTAD衍生法测定25(OH)D3的水平。由于血浆样本中，25(OH)D2的水平一般为1.0 ng/ml左右，本研究中血浆样本的25(OH)D2的水平均未达到所建立方法的定量限(S/N≥10)，这与本研究中所建立方法中的25(OH)D2检测限接近实际样本中含量且高于其他研究者报道的检测限有关[10-11]。接下来，本团队将继续探究VitD，特别是直接检测其活性形式“1,25-(OH)2D3”的LC-MS/MS方法。

VitD缺乏与多种疾病的发生发展密切相关，近年研究发现VitD与糖尿病血管并发症密切相关，但具体的分子机制仍不明确。有研究显示，糖尿病患者VitD缺乏与糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变以及心血管疾病的发生率呈负相关；补充VitD则可降低上述疾病的发生率[12-13]。本研究结果表明：Ⅱ型糖尿病患者血浆25(OH)D3水平显著低于健康人平均值；该研究结果与先前报道一致。近年研究显示，高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)是VitD的一个重要载体；糖尿病患者血浆中VitD减少，则HDL上的VitD水平也可能下降，我们尚未发表的数据证实了我们的推测(26例糖尿病患者HDL所携带的25(OH)D3较24例健康人HDL上的25(OH)D3水平下降了35%，P<0.05)，该显著性差异是否影响HDL的功能及其潜在的分子机制正在深入探讨中。此外，通过研究VitD来探讨糖尿病及其并发症的发病机制，有可能为糖尿病及其并发症的预防和治疗提供新的理论依据和解决方案。

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