米非司酮片对早孕绒毛中IGF-II及MMP-9表达的影响*

张旭东

(解放军八十八医院妇产科，山东 泰安 271000)

胚泡植入到子宫内膜的过程是一个受多种细胞因子调节、涉及一系列信号传导、复杂而精细的生物学过程，植入过浅会导致流产、胎儿生长受限等病理情况的发生。绒毛滋养细胞分泌的蛋白水解酶对细胞外基质的降解在胚泡植入中起关键作用，基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)是降解细胞外基质(ECM)最重要的一类水解酶，MMP-9属于基质金属蛋白酶系统中的明胶酶类，能介导滋养细胞的侵入，影响胎盘和胎儿的发育[1-2]。胰岛素样生长因子-II(insulin-like growth factor-II，IGF-II)在合体滋养细胞、细胞滋养细胞及羊膜绒毛层内均有表达[3]。米非司酮为孕激素受体拮抗剂，与孕酮竞争受体而达到拮抗孕酮的作用，其与孕酮受体的亲和力是孕酮的5倍。

本研究通过检测米非司酮预处理的早孕妇女绒毛及正常早孕绒毛中IGF-Ⅱ及MMP-9的表达， 探讨米非司酮片在终止早孕中的作用机制。

1 资料和方法

1.1研究对象及分组

1.1.1正常早孕组 选取2011年9月至2013年2月因计划生育因素自愿到八十八医院计划生育门诊人工流产的早孕妇女20例。标准:(1)年龄在20～35岁之间；(2)月经规律，停经6～7周，彩超证实为宫内妊娠且见胚芽或胎心搏动；(3)妊娠前3个月及妊娠后未使用过甾体激素，本次妊娠期间无阴道流血、腹痛等先兆流产症状；(4) 无死胎、死产及自然流产史，排除子宫畸形、染色体、内分泌及解剖结构等方面的异常及自身免疫性疾病与生殖道感染。

1.1.2米非司酮预处理组 选取同一时间早孕妇女10例，标准同正常妊娠组，所有入选对象均自愿口服米非司酮片25 mg每日2次，3天，第4天上午行清宫术留取绒毛标本。

1.2材料和方法

1.2.1绒毛组织 无菌采集研究对象绒毛组织，约1×1×1 cm3，生理盐水漂洗，置于冻存管内封存后-70℃储存待检，以提取组织总RNA。

1.2.2引物序列 IGF-II：上游引物，5'- ACTCGGCCAGAGCGGCG -3'，下游引物，5'-GCACCAGCATCGACTTCCCCA-3'；MMP-9上游引物5'-GGTGGACCGGATGTTCCCCG-3'，下游引物，5'-CGCGCCAGTAGAAGCGGTCC-3'；GAPDH: 上游引物，5'-A CCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCTGTTGCTGTA-3'(上海生工生物工程有限公司)。

1.2.3主要试剂及仪器 Trizol Reagent(Invitrogen公司)。Reverse Transcription System(TAKARA公司)。SYBROR Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time) (TAKARA公司)。Nanodrop2000型核酸分析仪(Thermo)，ABI9700型PCR仪(ABI)。米非司酮为北京紫竹药业有限公司生产。

1.2.4实验方法 RT-PCR 严格按照说明书步骤提取总RNA。测得OD260/OD280在1.8～2.0之间。1.5% agarose gel 2～4 μl RNA上样，电泳检测RNA完整性。按照逆转录试剂盒说明书步骤合成cDNA。设定以下PCR程序：95℃ 30秒，95℃ 5秒，60℃ 30～34秒共40个循环。计算△Ct值，进而计算2-△Ct。

1.2.5统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验，显著性检验水平为0.05。

2 结 果

米非司酮预处理组绒毛中IGF-ⅡmRNA的表达水平低于对照组，差异无统计学意义(P>0.05)，MMP-9 mRNA的表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 各组绒毛组织中IGF-II与MMP-9 mRNA的相对表达

3 讨 论

早孕期胚泡植入到子宫内膜的过程是非常复杂的，涉及到多个细胞因子的调节，其调节机制非常精细、复杂。此过程受母体多个免疫系统的调节，是母体与胚胎相互调节、共同作用的结果，此期的子宫内膜具有较好的容受性，与胚泡同步发育，出现一个允许胚胎植入的较为短暂的时期，称为种植窗期。

胚泡的植入在时间和空间上均受到母体免疫系统的严格控制，时间上表现为滋养细胞侵入子宫内膜的过程终止于妊娠中期，空间上则表现为滋养细胞仅侵入子宫脱膜及近1/3的子宫肌层。如免疫系统或调节因子表达异常，绒毛的侵入就会过深或过浅，从而导致滋养细胞疾病、流产、胎儿生长受限、子痫的病理情况，在这一过程中MMPs及MMPs与其抑制因子的相互协调平衡起着重要的作用。MMP-9属于MMPs中的明胶酶类，主要降解Ⅳ胶原及其他ECM,如胶原Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ, 层黏连蛋白,纤维连接蛋白及玻连蛋白[4]。MMP-9是绒毛滋养细胞降解细胞外基质的限速酶。MMP-9在绒毛外细胞滋养层细胞中呈显著高表达[5]。

IGFs 是体内重要的生长因子，通过自分泌、旁分泌等方式对组织细胞的增殖、分化、凋亡、机体的生长发育及肿瘤的发生发展起重要的调节作用。IGF-II mRNA在人早孕绒毛滋养层细胞中表达率为100%，绒毛小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞中均有IGF-II表达[6]。胚胎着床的各个环节中都有IGFs的参与调节。Irwind等发现IGFs可以促进滋养细胞分泌MMPs，进而加强滋养细胞向子宫脱膜的侵入。

本研究采用实时荧光定量PCR技术检测6～7周正常早孕绒毛组织中及经米非司酮预处理后的早孕绒毛组织中IGF-II mNA、MMP-9 mRNA的表达，显示经米非司酮预处理后早孕绒毛组织中IGF-II mRNA的表达虽低于对照组，但差异不明显，无统计学意义(P>0.05)；而MMP-9 mRNA的表达却明显低于对照组，差异有统计学意义。MMP-9表达降低，导致滋养细胞降解细胞外基质能力下降，浸润能力减弱，绒毛侵入不足，进而影响滋养细胞对子宫脱膜及肌层的浸润和血管重铸，最终导致流产。这可能是米非司酮片能用于终止早孕的一个作用机理，当然其在终止早孕过程中的具体作用机制尚待进一步研究证实。

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