致康胶囊对大鼠急性软组织损伤及外伤致血瘀的药效学研究

沈 欣，赵宗平，李德凤，宗桂珍，何 伟

(1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700;2.西安千禾药业有限责任公司，西安 710065)

致康胶囊是由西安千禾药业有限责任公司生产的中药制剂，由大黄、黄连、三七、白芷、阿胶、龙骨(煅)、白及、醋没药、海螵蛸、茜草、龙血竭等14味中药组成，其气微香、味辛凉、微苦，具有清热凉血、止血化瘀、生肌定痛的功效，可用于创伤性出血、呕血、崩漏及便血等。该方是在七厘散、腐尽生肌散等经典名方基础上根据临床经验和实验研究而组成，临床用于妇科、内科、外科各种出血性疾病，均有较好的疗效和修复功能。临床应用表明，本药具有明显的止血、促进组织修复、消炎功效。围绕以上功效，本试验拟以大鼠急性软组织损伤动物试验进一步探讨其药效及作用机制。

1 目的

观察致康胶囊口服不同剂量，对大鼠急性软组织损伤及外伤致血瘀证是否具有抑制肿胀和消散瘀血作用。

2 材料

2.1 动物

SD雄性大鼠75只，SPF级，体质量280～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证编号SCXK(京)2012-0001)。

2.2 饲料

饲料购自北京市科澳协力饲料有限公司(产品许可证号 SCXK(京)2009-0012，产品批号12093211，生产日期20120909)。

2.3 动物饲养

试验期间动物饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所动物房(实验设施许可证SYXK(京)2010-0032)。动物房为屏障系统，人工光照，12 h明暗周期，温度控制在20～22℃范围，相对湿度为40% ～70%，换气次数15次/h。动物饲养于塑料大鼠饲养笼，每笼5只，每天更换鼠笼垫料1次。用500 ml塑料饮水瓶盛装纯净水，供动物随意饮用，每日更换新鲜饮水。

2.4 药物

致康胶囊由西安千禾药业有限责任公司提供(批号20120611)，云南白药由云南白药集团股份有限公司生产(批号Z12003，生产日期2012年5月23日，有效期至2017年4月)。

2.5 仪器

卡尺(型号ELECTRONIC DIGITAL CALLIPER，规格0～150 mm)，香港丰量国际集团有限公司;旋转黏度计仪，北京普力生仪器有限公司(型号LBY-NW1)。

3 方法

3.1 动物分组

取健康SD大鼠按体质量随机均匀分成正常对照组、击打模型组、击打加云南白药组(200 mg/kg)、击打加致康胶囊高、中、低(给药剂量分别为680、340、170 mg/kg)6 组，每组12 只。致康高、中、低剂量相当于人临床用量的11、5.5、2.7倍，人临床用量以每日3次、每次12粒为标准。相当于临床等效剂量的2、1、0.5倍。试验分2 d做，每组各半。各组于击打后24 h、47h分别给药1次。

3.2 造模

预防给药1 d，第2天右小腿脱毛，先测量右小腿中部直径正常值，给药组给药1 h后将动物腹卧位固定，右小腿中部外侧对准击打处，以自由落体击打仪击打右小腿外侧，击打高度为10.5 cm，重1013 g，击打2次。

3.3 观测指标

3.3.1 软组织肿胀度及瘀斑面积 击打后2、24、48 h以卡尺测量右小腿中部直径和瘀斑面积(长 ×宽)。

3.3.2 血液流变学指标 于末次给药后1 h以20%乌拉坦腹腔注射麻醉1 g/kg，由腹主动脉取血，枸椽酸钠(3.8%)抗凝(1∶9)，用于血液流变学指标测定。

3.3.3 血小板聚集测定 部分血液1000 r/min，离心10 min制备富血小板血浆(PRP)，取出一定量备用。再将剩余部分血清3000 r/min离心15 min制备贫血小板血浆(PPP)。将PRP与PPP按一定比例混合，用血小板聚集仪将透光度调至4000左右，此时血小板数为3×1012/L，ADP(1∶200)为诱导剂，测定5 min内血小板聚集的最大聚集率。

3.3.4 全血黏度测定 700 μL全血缓慢加入旋转黏度计仪器测定杯中37℃预温1min，测定10 S－1、50 S－1、200 S－1切变率的全血黏度。

3.3.5 血浆黏度测定 将200 μL血浆吸入毛细管中，测定37℃时的血浆黏度。

3.3.6 红细胞压积测定 用微量毛细管吸入一定时的血液高速离心机12000 r/min离心15 min，以专用计数板读出红细胞压积百分数。

3.3.7 血浆纤维蛋白原(FIB)含量测定 采用Clauss凝固法原理按试剂盒说明书方法在PRECIL C2000-4血凝仪上测定。

3.3.8 病理组织学检查 将麻醉取血后的动物右小腿皮肤、肌肉组织于10%福尔马林中固定，浸蜡包埋、切片、苏木素/伊红染色、光学树脂封片、光学显微镜下观察、照相。肉眼大体病变程度分级和显微镜下病变分级标准同大鼠软组织损伤实验。

3.4 统计学方法

采用SPSS统计学软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差(s)表示，比较用t检验，等级处理用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 致康胶囊对大鼠急性软组织损伤的影响

阳性药、致康胶囊3个剂量组均减轻大鼠急性软组织损伤肿胀程度和损伤瘀斑面积，作用时间48 h较为明显，说明本品能明显减轻急性外伤所致动物软组织损伤程度。

表1 致康胶囊对大鼠急性软组织损伤肿胀度的影响(n=12)

表2 致康胶囊对大鼠急性软组织损伤瘀斑面积的影响(n=12)

4.2 致康胶囊对大鼠急性软组织损伤后血流变的影响

在对大鼠急性软组织损伤后血液流变学5个指标(血小板聚集、全血黏度、血浆黏度、红细胞压积、血浆纤维蛋白原)测定后发现，致康胶囊与模型组比较，致康胶囊高剂量血小板聚集、PT均有明显升高，致康胶囊高、中剂量纤维蛋白、全血黏度明显升高，均有利于外伤动物模型止血和促进损伤修复。

表3 致康胶囊对大鼠急性软组织损伤血液流变学指标的影响(s)

表3 致康胶囊对大鼠急性软组织损伤血液流变学指标的影响(s)

注:与模型组比较:*P＜0.05

组 别 剂量(mg/kg)动物数(只)红细胞压积(%)全血黏度10 S－1(mPa·s)全血黏200 S－1(mPa·s)血浆黏度(mPa·s)PT(s)纤原含量(g/L)血小板聚集(%)空白对照组 10 44.68±1.24 6.91±0.45 3.79±0.18 1.00±0.03.03 12.87±0.48 4.70±0.29 52.62± 7.18 13.85±1.08 4.00±0.43 48.22± 5.82模 型 组 12 41.91±1.52 6.56±0.69 3.70±0.20 1.03±0.04 12.88±0.68 4.68±0.45 50.28± 8.87云南白药组 200 12 41.27±1.93 6.49±0.61 3.65±0.14 1.03±0.03 12.63±0.32 4.98±0.23* 50.49± 8.46致康胶囊组 680 12 41.40±1.91 6.39±0.65 3.91±0.27* 1.03±0.04 13.64±0.85* 4.77±0.35* 58.43± 8.85*340 12 41.86±2.49 7.42±1.34 3.94±0.24* 1.04±0.03 12.82±0.86 4.88±0.41* 59.51±11.52 170 12 41.72±2.35 6.60±0.78 3.69±0.23 1.01±0

4.3 致康胶囊对大鼠急性软组织损伤组织病理学影响

4.3.1 皮肤 空白对照组动物的皮肤各层结构清晰，表皮、真皮及皮下组织未见异常;模型组、云南白药组及致康胶囊各剂量给药组真皮及皮下组织内可见不同程度的出血、渗出及单个核炎细胞为主的炎细胞浸润。上述病变模型组、云南白药组及各剂量给药组与空白对照组比较，差异均有统计学意义;皮肤出血病变致康胶囊高剂量组较模型组有所减轻，其余各给药组与模型组比较，差异无统计学意义;皮肤炎症病变各给药组与模型组比较差异均无统计学意义。

4.3.2 肌肉 空白对照组肌肉的肌外膜、肌束膜及肌内膜结构清晰，肌纤维未见明显异常;模型组、云南白药组及致康胶囊各剂量给药组肌肉的肌外膜、肌束膜及肌纤维间均有不同程度的出血、渗出和单个核炎细胞为主的炎细胞浸润，肌纤维间距增大，存在不同程度的变性、坏死和巨噬细胞为主的炎细胞浸润。上述病变模型组、云南白药组及致康胶囊各剂量给药组与空白对照组比较，差异有统计学意义;肌纤维变性坏死病变云南白药及致康胶囊高剂量组有所减轻，其余各组与模型组比较差异无统计学意义;肌外膜、肌束膜及肌纤维间出血、渗出病变与模型组比较，致康胶囊高剂量组明显减轻且有统计学意义(P＜0.01)，云南白药组有所减轻但差异无统计学意义，其余各组与模型组比较差异无统计学意义;肌纤维炎症浸润病变，与模型组比较各组均有所减轻。各组的具体病变分级情况见表4～8，肌肉病变病理见图1。

表4 致康胶囊对大鼠皮肤出血病变的影响

表5 致康胶囊对大鼠皮肤炎症病变的影响

表6 致康胶囊对大鼠肌肉变性坏死病变的影响

表7 致康胶囊对大鼠肌肉出血渗出病变的影响

表8 致康胶囊对大鼠肌肉炎症病变的影响

图1 模型组(皮肤，HE×200)真皮及皮下组织内可见大量红细胞渗出及轻微单个核炎细胞为主的炎性浸润，皮肤附属毛囊结构正常;图2 云南白药组(皮肤，HE×200)真皮及皮下组织内可见小片状红细胞渗出及单个核炎细胞为主的炎性浸润;图3 致康胶囊(皮肤，HE×200)真皮及皮下组织内可见散在少量红细胞渗出及轻微的单个核炎细胞为主的炎性浸润;图4 模型组(肌肉，HE×200)可见大片肌纤维变性坏死，巨噬细胞为主的炎细胞浸润及轻微的肌纤维间出血;图5云南白药组(肌肉，HE×200)可见片状肌纤维变性坏死，巨噬细胞为主的炎细胞浸润及轻微的肌纤维间出血;图6 致康胶囊(肌肉，HE×200)可见片状肌纤维变性坏死，巨噬细胞为主的炎细胞浸润及轻微的肌纤维间出血

5 结论

软组织由于机械性损伤能使组织断裂或细胞破裂，击伤的强弱和持续时间的不同引起的后果也不同。本实验采用直接击伤的方法造成动物软组织损伤，所选用的打击势能是根据动物的体质量确定，击伤后不久大鼠的伤肢出现肿胀、皮下瘀血及软组织损伤，局部皮肤、皮下、深部肌组织、小血管受损，严重者可出现肌纤维、胶原纤维的断裂;毛细血管破裂、血管壁通透性增加、血管内液外渗组织间隙，导致肿胀和组织充血、坏死。同时血液流变学各指标的改变具有明显的时相关系，即外伤后1 h之内为高凝状态，外伤后3 h即转入低凝状态。本试验表明，致康胶囊对动物伤肢肿胀均有明显的防治作用，并具有一定的化瘀止血功能，与模型组比较，纤维蛋白原、血小板聚集、PT以及血液黏度的升高都有助于止血，对机体软组织损伤起到明显的改善和修复作用。具体表现在对炎症组织消肿吸收，以及使凝血状态下血流变学指标趋向于正常化状态，这与我们临床应用所得到结论是一致的。以上结果表明，致康胶囊具有以下较明显的药理作用:一是消肿生肌作用，可明显降低模型动物软组织肿胀及损伤程度;二是活血化瘀作用，改善模型动物局部组织充血、瘀血状况，减少出血;三是修复作用，通过改善提高局部血液流变以促进损伤修复。

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