海绵中石油降解微生物的分离筛选及降解特性研究

吴佩春， 王海涛， 刘亚男， 信艳娟， 曹旭鹏， 薛 松∗

中国科学院大连化学物理研究所，海洋生物产品工程组，辽宁大连116023

海绵中石油降解微生物的分离筛选及降解特性研究

吴佩春1， 王海涛1， 刘亚男1， 信艳娟1， 曹旭鹏1， 薛 松1∗

中国科学院大连化学物理研究所，海洋生物产品工程组，辽宁大连116023

从大连湾原油污染海域生长的海绵中分离筛选到一株原油降解菌OA58，根据其生长形态、培养特征、16S rRNA序列相似性比对分析和生化指标检测，初步鉴定为脱叶链霉菌（Streptomyces exfoliatus）。同时，考察了该链霉菌对原油的降解效果，OA58能以原油为唯一碳源生长，在人工海水培养基中，14 d内对原油（初始浓度为1 g／L）的平均降解率为83%，是一株具有开发潜力的原油降解放线菌。

原油；海绵；鉴定；生物降解

近年来，海上石油开发活动频繁，运输过程中造成的海上溢油事故时有发生，给海洋环境造成了严重的污染，极大地破坏了海洋的生态平衡。为应对溢油事故的发生及日后的环境修复［1，2］，目前，利用微生物降解石油被认为是处理海洋石油污染最环保的方法之一［3～6］。对于石油降解微生物的研究，人们已经从近海环境扩展到大西洋、极地等极端环境［7～9］，这些降解微生物主要是从海水或海泥等样品中分离得到的。

海绵作为低等的滤食性海洋动物，体内富集了丰富的海洋微生物。有些微生物与海绵互利共生，形成海绵共生微生物，这些共生微生物不仅能为海绵提供营养物质和能量［10］，还可通过产生的具有生物活性的化合物，参与到海绵的生物防御系统中，其中一个重要的功能就是降解污染物［11］。因此，从海绵中分离具有降解功能的微生物，用于海洋环境的生物修复具有一定的意义。

本文从海绵中分离到一株的原油降解菌，命名为OA58，根据其生长形态、培养特征、16S rRNA序列相似性比对分析和生化指标检测，对该菌株进行了初步鉴定，并且研究了其对原油的降解能力。

1 材料与方法

1．1 培养基和溶液

菌株分离所需培养基和溶液包括：

人工海水培养基（ASM）：MgSO4·7H2O 7．0 g／L，KCl 0．7 g／L，KH2PO42．0 g／L，Na2HPO43．0 g／L，NH4NO31．0 g／L，NaCl 30 g／L，原油1 g／L，pH 7．2。每升培养基中加入微量元素液10 mL。液体培养基中加入18 g／L琼脂，为固体平板分离培养基（ASM1）。

微量 元 素 溶 液：CaCl220 mg／L，FeCl350 mg／L，CuSO40．5 mg／L，MnCl2·4H2O 0．5 mg／L，ZnSO4·7H2O 10 mg／L。

固体平板纯化培养基（2216E，Difco）：蛋白胨5．0 g／L，酵母提取物1．0 g／L，柠檬酸铁0．1 g／L，NaCl 19．45 g／L，MgCl25．9 g／L，MgSO4·7H2O 3．24 g／L，CaCl21．8 g／L，KCl 0．55 g／L，NaHCO30．16 g／L，KBr 0．08 g／L，SrCl20．034 g／L，H3BO30．022 g／L，Na2SiO30．004 g／L，NaF 0．002 4 g／L，NH4NO30．001 6 g／L，Na2HPO40．008 g／L。

ISP⁃2培养基：酵母提取物4．0 g／L，麦芽提取物10．0 g／L，葡萄糖 4．0 g／L，琼脂 15．0 g／L，pH 7．3。

1．2 菌株的分离筛选

菌株分离筛选方法参考文献［12］进行。自大连湾石油污染海域采集海绵样品，用无菌海水清洗去除样品表面杂质，研磨至匀浆状，加入人工海水培养基中，28℃、200 r／min培养7 d，反复转接3次，以原油（浓度1 g／L）为唯一碳源和能源进行富集。梯度稀释涂布固体平板分离培养基，28℃培养7～10 d，挑取单菌落于2216E纯化培养剂划线分离单菌，得到纯培养。

1．3 菌株鉴定

对分离纯化得到的菌株通过形态观察、生理生化试验、16S rRNA序列同源性比对分析，确定其分类地位。菌株的形态及生理生化特性测定参照文献［13，14］进行。将分离纯化获得的菌株OA58在ISP⁃2培养基上培养3 d，按照参考文献［15］方法提取菌株基因组DNA，进行16S rRNA PCR扩增［12，16，17］，测序后进行Blast比对，采用Clustalx1．81软件构建进化树［18］。

1．4 菌株降解特性

菌株OA58的降解特性及分析方法参考文献［12］方法进行。菌株OA58在人工海水培养基（含原油1 g／L）中30℃、200 r／min培养14 d，培养物用等体积的二氯甲烷和正已烷（V∶V＝1∶1）萃取，有机相为培养物中未降解原油，通过GC⁃FID、GC⁃MS对进行分析定量，同时用重量法计算降解率。

2 结果与分析

2．1 菌株OA58的鉴定

2．1．1 形态培养特征 通过以原油（1 g／L）为唯一碳源和能源，筛选到一株细菌，命名为OA58。在光学显微镜下，菌株OA58基内菌丝、气生菌丝和孢子丝的形态如图1（彩图见封三图版）所示。OA58孢子丝直或柔曲，孢子卵圆形至长圆形，表面光滑。在ISP⁃2培养基上菌株OA58生长丰茂，菌落呈白色，凸起，有褶皱，表面干燥且光滑。基内菌丝无色或浅褐色，气生菌丝黄白或灰白色，无可溶性色素。菌株OA58在多数实验培养基上长势良好，但在查氏培养基和高氏一号上长势较差（见表1）。在不同培养基上，基内菌丝颜色乳白至乳黄色，气生菌丝白色至黄白色。所有供试培养基上均不产生可溶性色素。

图1 菌株OA58的菌丝与分生孢子形态（×400）Fig．1 Mycelial and conidia of strain OA58（×400）．

表1 菌株OA58在不同培养基中的生长特征Table 1 Growth characteristics of strain OA58 on differentmedia．

2．1．2 生理生化鉴定 部分生理生化特征鉴定结果见表2。该菌不利用纤维素，水解淀粉能力强，明胶液化，不产H2S，不产酪氨酸酶，牛奶胨化并凝固，接触酶阳性。参考细菌分类鉴定手册，结合菌株OA58在各种培养基上的生长形态特征，可初步判定该菌为脱叶链霉菌（Streptomyces exfoliates）。

表2 菌株OA58生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain OA58．

2．1．3 分子鉴定结果 经16S rRNA序列比对分析，与菌株OA58的16S rRNA基因序列相似度最高的菌株为Streptomyces exfoliatus RCS07，相似性达到99%。采用Clustal x1．81软件，用N⁃J法建立系统进化树（图2）。菌株OA58与Streptomyces exfoliatus RCS07处于同一分枝，62%的自展值说明了这一亚枝的稳定性。结合菌株OA58的形态特征和部分理化指标的分析，进一步确定菌株OA58属于脱叶链霉菌（Streptomyces exfoliatus）。

图2 菌株OA58 16S rRNA基因序列进化树分析Fig．2 Phylogenetic tree of strain OA58 based on nearly full length 16S rRNA gene sequences．

图3 菌株OA58降解前后原油中烷烃组分气相色谱图Fig．3 Gas chromatogram of the the alkane fraction in crude oil before or after biodegradation of strain OA58．

2．2 原油降解实验

对菌株OA58培养物中原油中烷烃组分的气相色谱图实验结果（图3）表明，菌株OA58能够以原油为唯一碳源进行生长。通过摇床培养14 d后，菌株OA58对石油中的不同长度的烷烃组分都有一定程度的降解，对不同长度的烷烃降解率不同，对中长链烷烃（C17～C30）的降解率都达到50%以上（图4）。采用重量法计算其降解率，该菌株对原油的降解率达83%。

图4 菌株OA58对原油中各不同链长烷烃的降解率Fig．4 Percentage of n⁃alkane degradation in crude oil by strain OA58．

3 讨论

石油是一种复杂的混合物，主要是由烃类和非烃类组成，其中烃类占95%～99．5%［19］。

在石油污染海域我们发现，海绵和海鞘等海洋生物有较强的抗污和自洁能力，生长状态仍然良好。推测可能是海绵共生微生物参与海绵对石油污染的防御反应，其中最大的可能是石油污染引起海绵共生微生物群落多样性的变化，使得石油降解菌迅速增加，成为优势菌群，以加强海绵的生物修复功能，适应环境的突变。因此，从海绵中筛选出具有高效石油降解能力的微生物，探索该类海绵共生微生物对环境的修复作用，可以为海洋石油污染的生物修复提供理论和技术基础。

本文以原油污染海域生长的海绵为分离样品，分离筛选到一株原油降解菌，命名为OA58，根据其生长的形态、培养特征、生理生化检测结果和16S rRNA基因序列分析，初步鉴定为脱叶链霉菌（Streptomyces exfoliatus）。对其降解功能进行了初步的研究，结果表明，菌株OA58对原油的降解率是83%，其对原油组分的中长链烷烃有明显降解优势。到目前为止，尚未发现有关脱叶链霉菌（Streptomyces exfoliatus）降解石油的报道，根据实验结果显示，菌株OA58的石油烃降解能力，以及其海洋来源的特点，为该菌株在海洋溢油的生物修复中具备良好的应用前景。

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Sreening of Crude Oil Degrading Bacteria and its Degradation Capability

WU Pei⁃chun1，WANG Hai⁃tao1，LIU Ya⁃nan1，XIN Yan⁃juan1，CAO Xu⁃peng1，XUE Song1∗
Marine Bioproducts Engineering Group，Dalian Institute ofChemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Liaoning Dalian 116023，China

A strain of crude oil degrading bacteria OA58 was isolated from a crude oil contaminated marine sponge from Dalian Bay，China．According to the 16S rRNA genes sequences analysis，physiological and biochemical characterizations，the strain OA58 was identified as Streptomyces exfoliatus．When the initial concentration of crude oil was 1 g／L，the strain OA58 could consume 83%of the crude oil in 14 days，indicating a good potential of degradation capability of crude oil．

crude oil；marine sponge；identification；biodegradation

10．3969／j．issn．2095⁃2341．2014．01．09

2013⁃10⁃18；接受日期：2013⁃11⁃26

国家自然科学基金项目（31100092）；受格平绿色助学行动辽宁环境科研‘123工程’（CEPF2010⁃123⁃2⁃20）资助。

吴佩春，实验师，研究方向为海洋微生物。E⁃mail：peichunwu＠dicp．ac．cn。∗通信作者：薛 松，研究员，主要从事生物活性物质结构与功能研究。Tel：0411⁃84379069；E⁃mail：xuesong＠dicp．ac．cn