旋毛虫的低温耐受性和感染性的实验研究

秦啸鸣,宋 辉,傅 皓,张 军,王国英,白慧玲*

(1.河南大学医学院,河南开封475004;2.河南大学医学院细胞与分子免疫学实验室,河南开封475004)

旋毛虫的低温耐受性和感染性的实验研究

秦啸鸣1,宋 辉1,傅 皓1,张 军2,王国英2,白慧玲2*

(1.河南大学医学院,河南开封475004;2.河南大学医学院细胞与分子免疫学实验室,河南开封475004)

目的 观察旋毛虫的低温耐受性和感染性。方法 20只雌性昆明小鼠被随机分为对照组和实验组,实验组根据温度不同分3组,共4组,每组5只。对照组每鼠经口感染150条肌幼虫。实验组①组(低温1 h组):肉样置于-18℃、1 h;②组(低温4 h组):肉样置于-18℃、4 h;③组(低温24 h组):肉样置于-18℃、24 h;经低温处理的3组鼠肉取出后,室温下(16℃)彻底融化,磁力搅拌法(消化2 h)收集幼虫。然后分别人工灌胃小鼠,每鼠经口感染150条肌幼虫。所有小鼠感染后28 d剖杀,取膈肌压片镜检,并用磁力搅拌法收集肌幼虫、计数。结果 对照组、低温1 h组、低温4 h组和低温24 h组的肌幼虫均数分别为:5 490.40、2 397.60、319.60、0;低温1 h组和低温4 h组2组的肌幼虫均数显著低于对照组(P＜0.01);低温4 h组的肌幼虫均数低于低温1 h组(P＜0.05)。结论低温(18℃)对旋毛虫具有杀伤作用,旋毛虫囊内幼虫的活力和感染性与冷冻时间和肉样厚度均有直接关系。

旋毛虫;低温耐受;感染性;小鼠

旋毛虫病是一种动物源性寄生虫病,目前已知猪、野猪、狗、鼠等150多种动物自然感染有旋毛虫。旋毛虫(Trichinella spiralis)的成虫和幼虫寄生于同一宿主,成虫主要寄生在宿主的十二指肠和空肠上段,幼虫寄生在横纹肌细胞内,在肌肉内形成具有感染性的幼虫囊包。猪是人体旋毛虫病的主要传染源。旋毛虫病不仅严重危害人体健康,对养猪业也可造成巨大的经济损失。食用猪肉的无害化处理能降低感染风险,减少感染机会;只有消灭传染源,切断传播途径,才能保护易感人群。我们的实验通过对旋毛虫的低温耐受性和感染性之间关系的研究,为食用猪肉的无害化处理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 旋毛虫虫种

引自河南省疾病预防控制中心,用小白鼠传代保种的旋毛虫;实验前以肌幼虫转种小白鼠备用。每鼠经口感染150条肌幼虫。

1.2 实验方法

35日龄雌性昆明小鼠,体质量18～22 g,购自郑州大学实验动物中心。20只小鼠被随机分为对照组和实验组,实验组分为3组,共4组,每组5只。

1.2.1 对照组 将感染旋毛虫肌幼虫30 d后的小鼠引颈处死,磁力搅拌法(消化2 h)收集幼虫。每鼠经口感染150条肌幼虫。

1.2.2 实验组 感染旋毛虫肌幼虫30 d后的小鼠引颈处死,小鼠肉剪碎,将肉样置不锈钢槽,钢槽体积为20 mm×20 mm×20 mm。低温1 h组:肉样置于-18℃、1 h;低温4 h组:肉样置于-18℃、4 h;低温24 h组:肉样置于-18℃、24 h。经低温处理的3组鼠肉取出后,室温下(16℃)彻底融化,磁力搅拌法(消化2 h)收集肌幼虫。然后分别人工灌胃小鼠,每鼠经口感染150条肌幼虫。

1.3 肌幼虫检查

所有小鼠感染后28 d处死,取膈肌压片镜检,并将全部肌肉人工消化后计数肌幼虫数。取小鼠全部肌肉(去皮、头尾、4爪及内脏),剪碎后加入人工消化液(胃蛋白酶1 g,盐酸1 m L,蒸馏水99 m L),置于恒温磁力搅拌器上,37℃搅拌2 h,待肌肉完全消化后经过滤、自然沉淀,无菌生理盐水漂洗3～4次,收集肌幼虫并计数,计算减虫率。减虫率=(对照组肌幼虫平均数-实验组肌幼虫平均数)/对照组肌幼虫平均数×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计分析软件进行数据处理和统计分析,采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 膈肌压片镜检

对照组小鼠感染28 d后,膈肌压片镜检,均检出肌幼虫,检出率为100%。实验组小鼠感染28 d后,低温1 h组和低温4 h组2组小鼠膈肌压片镜检,均检出肌幼虫,检出率为100%;低温24 h组,小鼠膈肌压片镜检,均未检出肌幼虫。

2.2 人工消化全部肌肉镜检

对照组小鼠感染28 d后,小鼠取全部肌肉,人工消化后镜检,均检出肌幼虫,检出率为100%。实验组小鼠感染28 d后,低温1 h组和低温4 h组2组小鼠取全部肌肉,人工消化后镜检,均检出肌幼虫,检出率为100%;低温24 h组小鼠取全部肌肉,人工消化后镜检,均未检出肌幼虫。低温1 h组、低温4 h组与对照组的肌幼虫均数差异均有非常显著性(q对照与1h=5.63,q对照与4h=9.42,P＜0.01);低温1 h组与低温4 h组的幼虫均数差异有显著性(q1h与4h= 3.78,P＜0.05)。见表1。

表1 感染28 d后各组小鼠肌幼虫检查结果(±s,n=5)

表1 感染28 d后各组小鼠肌幼虫检查结果(±s,n=5)

注:与对照组相比,*P＜0.01。

组别 感染虫数/条 检获肌幼虫数/条 减虫率/%对照组 150 5 490.40±1 771.76 0实验组低温1 h组 150 2 397.60±1 168.27*56.33低温4 h组 150 319.60±144.28*94.18低温24 h组 150 0 100.00

3 讨论

根据生物学和生物化学研究,尤其是基因分类学研究,将旋毛形线虫属分为8个种:即旋毛虫(T. spiralis)、北方旋毛虫(T.nativa)或乡土旋毛虫、布氏旋毛虫(T.britovi)、 伪旋毛虫(T.pseudospiralis)、米氏旋毛虫(T.murrelli)、南方旋毛虫(T.nelsoni)或纳氏旋毛虫、巴布亚旋毛虫(T. papuae)及津巴布韦旋毛虫(T.zimbabwensis),以及3个分类地位尚未确定的基因型,即Trichinella T6、T8和T9;我国已发现的旋毛虫有2种,即旋毛虫和乡土旋毛虫[1]。国内学者研究[2-6]证明,中国猪旋毛虫为T.spiralis,中国犬旋毛虫为T.nativa。

猪肉仍是我国人体旋毛虫病爆发的主要感染源[7]。人体感染旋毛虫病主要是由于食入了含有旋毛虫活幼虫囊包的肉类及其制品。幼虫囊包的抵抗力强,熏烤、腌制和暴晒等方式也不能杀死幼虫[8]。张玺等[9]的研究显示,用食用醋或酱油腌制肉类制品(腌肉、香肠和酸肉等),虽有可能降低旋毛虫肌幼虫的感染性和生殖力,但其效果可能受腌制时间长短、肉块大小等多种因素的影响,所以在实际应用中食用醋或酱油对旋毛虫肌幼虫的杀伤效果较难进行评价。0℃和20℃条件下,旋毛虫肌幼虫在干燥和生理盐水环境中能够生存长达10 d以上,并具有感染新宿主的能力[10]。感染旋毛虫的猪肉即使经过50～60 Mpa高压仍不能将肌幼虫全部杀灭[11]。

国际旋毛虫病委员会认可的3种能确保肉类安全的加工方法包括冷冻、放射及烹饪[12]。宋铭忻等[13]的实验结果显示,T.spiralis在猪体内-32℃、24 h,-22℃、72 h,在小鼠体内-32℃、12 h全部死亡,认为-30℃是一个关键温度,在此温度下,旋毛虫仅能存活短暂的时间。我们的实验结果显示,在-18℃条件下,当肉样厚度为20 mm时,经过1 h和4 h冷冻,在小鼠体内,低温1 h组的减虫率为56.33%,低温4 h组的减虫率为94.18%,囊内幼虫部分仍然有活力,具有感染性;但低温4 h组的肌幼虫均数显著低于低温1 h组,2组的肌幼虫均数又均显著低于对照组;经过24 h冷冻,低温24 h组的减虫率为100%,囊内幼虫均失活,感染性全部丧失。

上述结果说明,低温冷冻(-18℃)对旋毛虫具有杀伤作用,囊内幼虫随着冷冻时间的延长,活力减弱,感染性逐渐下降。但其死亡时间与囊包所在肉样的位置有关,位于肉样边缘部位的囊包,能在较短时间内被冻透,即可导致囊内幼虫死亡;位于肉样中心部位的囊包,在一定时间内未被冻透,囊内幼虫未受到致死的影响,幼虫得以存活,其活力和感染性依旧保持。因此,囊内幼虫的活力和感染性与冷冻时间和肉样厚度均有直接关系。低温冷冻-18℃,旋毛虫的感染性能够得到控制,但是要保证食用肉品的安全,冷冻肉块的厚度和冷冻时间之间的关系和影响还需要进一步探讨和研究。

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[责任编辑 姬 荷]

Studies on the infectivity and freeze resistance of Trichinella spiralis in mice

QIN Xiaoming1，SONG Hui1，FU Hao1，ZHANG Jun2，WANG Guoying2，BAI Huiling2*
（1.Medical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.Laboratory of Cellular and Molecular Immunology，Medical College，Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

Objective To observe the infectivity and freeze resistance of Trichinella spiralis.Methods Twenty female Kunming mice were randomly divided into one control group and three test groups，so 4 groups（with 5 mice per group）in total.For the control group each mouse was inoculated orally with 150 muscle larvae of T.spiralis. Test Group one's samples were stored at-18℃for 1h；test group two's samples were stored at-18℃for 4 h；test group three's samples were stored at-18℃for 24 h.All samples were taken out and thawed；muscle larvae of T.spiralis were collected by the magnetic stirrer method.Then，each mouse was orally inoculated with 150 disposed muscle larval of T.spiralis.All infected mice were sacrificed on the 28 th day after infectio，and muscle larval of T.spiralis were examined respectively by diaphragma compression method and digestion method for all infected mice.Results The average number of muscle larvae stored at-18℃for 1h and 4h were 2 397.60 and 319.60，respectively.These two groups'averages were obviously lower than that of the muscle larvae control group（P＜0.01）.Group two（4 h）'s averages were lower than that of the group one（1 h）（P＜0.05）.Conclusion Freezing does the vital harm to the muscle larval of T.spiralis.The activity and infectivity of muscle larvae are dependent on both freezing periods and muscle depth.

Trichinella spiralis；freeze resistance；infectivity；mice

R383.1

A

1672-7606(2014)02-0091-03

2014-02-15

国家级大学生创新创业训练计划(201210475067);河南大学校级教学改革项目(HDXJJG2013-138)。

秦啸鸣(1993-),男,河南开封人,本科在读生。

*通讯作者:白慧玲(1964-),女,河南尉氏人,教授,硕士生导师,从事免疫学的教学及科研工作。