光化学柱后衍生-高效液相色谱法测定婴幼儿营养米粉中的黄曲霉毒素B1

王桂苓，邢化冰，李琳琳，刘贝贝

(安徽省阜阳市产品质量监督检验所，安徽阜阳 236112)

光化学柱后衍生-高效液相色谱法测定婴幼儿营养米粉中的黄曲霉毒素B1

王桂苓，邢化冰，李琳琳，刘贝贝

(安徽省阜阳市产品质量监督检验所，安徽阜阳 236112)

建立婴幼儿营养米粉中黄曲霉毒素B1的高效液相色谱荧光检测器测定方法。样品以甲醇-水(体积比70∶30)溶液匀质提取，过黄曲霉毒素B1免疫层析亲和柱净化，经CNW Athena C18色谱柱分离和光化学柱后衍生反应器衍生后，用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定。采用峰面积外标法定量黄曲霉毒素B1含量。黄曲霉毒素B1在0～10 μg/L的浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.999 8，检出限为0.25 μg/kg。在3个添加水平下加标回收率为97.7%～106.9%，测定结果的相对标准偏差为1.7% (n=6)。该方法的灵敏度、准确度、精密度均符合黄曲霉毒素B1的检测技术要求，适用于婴幼儿营养米粉中黄曲霉毒素B1的日常检测。

婴幼儿营养米粉；黄曲霉毒素B1；光化学柱后衍生；高效液相色谱

黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的含有二氢呋喃环结构次级代谢物［1-4］，是迄今发现的毒性最强的一类真菌毒素，目前已发现的有20多种。黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2和M1等在食品中较常见，它们的毒性由大到小的排列顺序为黄曲霉毒素B1，M1，G1，B2，G2［5-7］。其中B1是目前所有已知致癌物中致癌力最强的一种［6-8］，其毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，1993年被世界卫生组织的癌症研究机构确定为一级致癌物［9-10］。大量研究发现，黄曲霉毒素B1不仅具有极强的致癌、致畸、致突变毒性，而且其急性毒性也很强。

婴幼儿时期是人生长发育最重要的时期，也是最脆弱的时期，婴幼儿食品的安全容不得半点马虎。辅食的材料大多是米、面为主，蔬果次之，如常见的婴幼儿营养米粉。我国国家标准［11］明确规定了黄曲霉毒素B1在婴幼儿食品中的限量为0.5μg/kg，该限量值明显低于谷物、豆类等其原料食品，因此婴幼儿食品中黄曲霉毒素B1的检测要满足检出限低的要求。婴幼儿食品中黄曲霉毒素B1的法定检测方法为薄层色谱法［12］，该法的原理：样品中的黄曲霉毒素B1经提取、净化、浓缩、薄层层析分离后，在波长365 nm紫外光照射下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光来测定其含量。薄层色谱法检测黄曲霉毒素B1具有灵敏度低、重现性差、操作繁琐、时间长且安全性差等缺点，已越来越不适合现代分析的要求［13］。高效液相色谱法检测粮食谷物［14-16］中黄曲霉毒素B1的研究较多，但婴幼儿食品中黄曲霉毒素B1的高效液相色谱法检测研究较少。20多年前罗建波等［17］曾研究过高效液相色谱法测定婴幼儿食品中的黄曲霉毒素B1，但由于当时的技术、设备水平所限，样品处理繁琐，不便推广应用。

笔者在前期研究的基础上［18］，换用新型色谱柱、优化流动相配比，大大缩短了分析时间，针对低含量样品采用低标准线性系列，成功地进行了婴幼儿营养米粉中黄曲霉毒素B1的免疫亲和层净化高效液相色谱法测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：L-2000型，配荧光检测器，日本日立高新技术公司；

高速均质机：T18型，广州市科学实验室技术有限公司；

高速离心机：TG16-WS型，湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；

光化学柱后衍生反应器：KRC-25型，北京泰乐琪科技有限公司；

黄曲霉毒素B1免疫层析亲和柱：北京泰乐琪科技有限公司；

甲醇：色谱纯；

黄曲霉毒素B1标准溶液：100 μg/mL，北京泰乐琪科技有限公司；

实验用水为屈臣氏蒸馏水。

1.2 色谱条件

色谱柱：CNW Athena C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：甲醇-水(体积比为55∶45)；流速：0.800 mL/min；荧光检测器：激发波长(Ex)为360 nm，发射波长(Em)为420 nm；进样量：20 μL。

1.3 实验方法

准确称取25.000 g样品于100 mL的具塞玻璃容量瓶中，用甲醇水(体积比为70∶30)溶液定容，摇匀后倒入250 mL的三角瓶中，并用25 mL的甲醇水溶液(体积比为70∶30)清洗容量瓶一并倒入三角瓶中，在高速匀质机上匀质2～3 min，取30 mL左右匀质后的样液以4 000 r/min离心5 min。取上层清液10 mL加入30 mL水稀释，摇匀后过玻璃纤维滤纸过滤，取10 mL的过滤液通过黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，直至2～3 mL的空气通过柱体，用10 mL的水冲洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2～3 mL的空气通过柱体。取下柱子用2 mL的甲醇进行缓慢洗脱，收集全部洗脱液进行测定。

将20 μL样品溶液和黄曲霉毒素B1标准溶液先后用液相色谱仪荧光检测器按1.2色谱条件进行测定，以保留时间定性，以响应峰面积外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 激发、发射波长的选择

试验了激发波长(Ex)360 nm和发射波长(Em)420，440，450 nm几种情况下的黄曲霉毒素的色谱峰情况，发现当同时测定黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2时，在Ex 360 nm， Em 420 nm条件下G1，G2的峰响应值偏低，B1，B2的峰响应值偏高，随着Em增大，B2，G2的峰响应有增大趋势，兼顾4个峰，Ex 360 nm， Em 450 nm为最佳检测波长；但在单独测定黄曲霉毒素B1时，Ex 360 nm， Em 420 nm为最佳检测波长。故采用激发波长360 nm和发射波长420 nm。

2.2 衍生方法

由于黄曲霉毒素B1具有较强的荧光性，但接触水后易发生荧光淬灭现象，荧光性基本消失，很难用液相色谱检测，所以需要用衍生的方法使黄曲霉毒素B1的荧光性增强。目前衍生的方法主要有三氟乙酸衍生法和碘衍生法。三氟乙酸衍生法操作步骤繁琐，实验重复性差，而且三氟乙酸毒性很强，对人体和环境的危害较大；碘衍生法需要柱后衍生泵，还要配制碘衍生液，操作也很繁琐［19］。而光化学柱后衍生反应器主要由反应线圈和纳米灯管组成，利用光化学的方法对黄曲霉毒素B1进行衍生，该装置不需要任何化学试剂，直接连接于色谱柱与荧光检测器之间，操作简单，检测结果准确，灵敏度高。因此实验选择光化学柱后衍生反应器，大大提高了工作效率。

2.3 流动相

采用甲醇-水作为流动相，试验了CNW Athena C18色谱柱在3种不同流动相配比(甲醇-水体积比分别为55∶45，50∶50，45∶55)下对目标物的分离情况。在甲醇-水体积比为55∶45流动相情况下，分离的色谱峰峰型单一、尖锐、对称，目标峰的分离度好，出峰时间最短，大大缩短了分析时间。故采用积比为55∶45的甲醇-水体作为流动相。黄曲霉毒素B1标样色谱图见图1。样品与加标样品色谱图见图2。

图1 黄曲霉毒素B1标样(0.1～10.0 μg/L)色谱图

图2 婴幼儿营养米粉样品(a)及其加标样品(b)色谱图

2.4 线性方程及检出限

用黄曲霉毒素B1标准溶液逐级稀释配制成质量浓度为0.1，0.25，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0 μg/L的标准系列溶液，对每个浓度水平分别测定(色谱图见图1)，以响应峰面积y为纵坐标，待测物的质量浓度x为横坐标，绘制标准曲线。结果显示，黄曲霉毒素B1在0～10.0 μg/L范围内，峰面积与浓度呈现良好的线性关系，线性回归方程为y=93 830x-4 548，相关系数为0.999 8。

随试样同时做空白试验，平行测定空白样10次，求出空白值的标准偏差，以3倍空白值的标准偏差除以线性方程的斜率，得方法的检出限为0.25 μg/kg，检出限满足我国婴幼儿食品中黄曲霉毒素B1的限量标准0.5 μg/kg［11］。

2.5 回收试验

采用空白样品中添加标准溶液的方法进行回收试验。准确称取相同的空白营养米粉试样3份，分别加入0.25，1.0，6.0 μg/L 3个不同浓度水平的黄曲霉毒素B1标准溶液，与样品本底同时进行提取处理和测定，回收试验结果见表1。由表1可知，在添加质量浓度为0.25～6.0 μg/L时，黄曲霉毒素B1的回收率为97.7%～106.9%，回收率的测定结果符合国标要求［20］。

表1 回收试验结果（n=3）

2.6 精密度试验

对加入1.0 μg/L标准溶液的样品进行6次平行测定，测定结果列于表2。由表2可知，测定结果的相对标准偏差为1.7%，表明该法精密度良好。

表2 精密度试验结果

3 结论

采用甲醇水溶液提取、免疫亲和层析柱净化，光化学柱后衍生-高效液相色谱法，建立了婴幼儿营养米粉中黄曲霉毒素B1的测定方法。对测定条件进行合理优化，降低了检出限，提高了回收率。该方法操作简便、快速，准确度高，灵敏度好，实用性强，适用于婴幼儿营养米粉中黄曲霉毒素B1的日常检测，便于在检测领域推广应用。

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《计测技术》2014年第34卷第2期目次

综述

动态力校准中需要规范的若干问题

理论与实践

一种摆式加速度计结构模态分析

一种EFPI光纤压力传感器的结构分析及零点稳定性

新技术新仪器

基于FPGA的超声三维坐标测量系统

液体流量标准装置变温系统设计

电能表温度影响试验自动测试系统

一种新研闭环大电流传感器校准装置

基于集散控制技术的某型电源控制器的设计与实现

轮胎气压表性能检测装置的研制

计量、测试与校准

飞秒激光频率梳测量光频用拍频装置的实验研究

基于平台测量的叶片榫头测具检测方法

基于QUINDOS6的整体叶轮叶型检测

误差与不确定度

稀释倍数对氦气中氩标准物质不确定度的影响

计量信息化及管理

数字化网络在计量管理中的应用

经验与体会

一种扩展白炽光通量标准灯使用范围的实用方法

提高密度计校准结果准确度的方法

恒温槽校准的四类因素的影响

浅议精密量具常用防锈油的熬制方法

Determination of Aflatoxin B1 in Rice Cereal for Infants and Young Children by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Post-Column Photochemical Derivatization

Wang Guiling， Xing Huabing， Li Linlin， Liu Beibei
(Fuyang Institute of Product Quality Supervision and Inspection， Fuyang 236112， China)

A high performance liquid chromatography(HPLC) coupled with post-column photochemical derivatization method was developed for the determination of aflatoxin B1 in rice cereal for infants and young children. The sample was extracted with methanol-water (volume ratio was 70∶30) then purified by immunoaffinity column for the purification aflatoxin B1. The high performance liquid chromatography (HPLC) separation was performed on a CNW Athena C18column with methanol and water. The aflatoxin B1 was determined by fluorescence detection (FLD) after photochemical derivatization，and quantified by the peak area external standard method. The calibration curve showed good linearity in 0-10 μg/L range with correlation coefficient of 0.999 8. The limit of detection (LOD) was 0.25 μg/kg for aflatoxin B1 in rice cereal for infants and young children. The recovery of aflatoxin B1 spiked at there levels in rice cereal for infants and young children ranged from 97.7% to 106.9% with the relative standard deviation(RSD) of 1.7% (n=6). The sensitivity，accuracy and precision of the method can meet the technical standards requirement of the aflatoxin B1 determination. Therefore the method can be applied to the determination of the aflatoxin B1 in rice cereal for infants and young children.

rice cereal for infants and young children; aflatoxins B1; post-column photochemical derivatization; high performance liquid chromatography (HPLC)

O657.7

A

1008-6145(2014)03-0028-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2014.03.008

联系人：王桂苓；E-mail: wangguiling0536@126.com

2014-01-11