酶法测定糖化血红蛋白的应用评价

孙金旗++++++任艳萍++++++巩姣梅

[摘要] 目的 评价酶法测定糖化血红蛋白的可行性。 方法 酶法和离子交换高压液相色谱分析法（HPLC法）同时检测91例糖尿病患者的糖化血红蛋白，对两组数据进行线性回归分析。 结果 酶法与离子交换高压液相色谱分析法的线性范围分别是2.5%～15.5%和3.8%～18.5%，批内精密度分别是1.09%和1.17%，批间精密度分别是2.2%和2.8%，酶法测定糖化血红蛋白的结果与离子交换高压液相色谱分析法测定糖化血红蛋白的结果相关性良好，线性方程y=1.0137x-0.072，R2=0.9886。酶法测定糖化血红蛋白结果与HPLC法测定的结果差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 酶法与离子交换高压液相色谱分析法有良好的相关性。酶法在全自动生化分析仪上检测具有效率高、成本低的优点，适合在临床上推广。

[关键词] 糖化血红蛋白；酶法；离子交换高压液相色谱分析法

[中图分类号] R446.11 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）09-0080-03

糖化血红蛋白是血液中己糖（主要是葡萄糖）的糖基连接到蛋白质的氨基酸残基而形成的。这是一个缓慢的、不可逆的非酶促反应，与血糖浓度和高血糖存在的时间相关[1]。持续的高血糖可增加血液中蛋白的糖化比例，蛋白质与葡萄糖结合后可发生变性，造成多器官功能衰竭，这是引起糖尿病（DM）慢性并发症的一个原因[2，3]。因此，糖化血红蛋白的检测是一个十分重要的检查项目。酶法作为可以在全自动生化分析仪上检测的方法近年来在实验室中得到推广。本文采用可溯源至IFCC的糖化血红蛋白检测试剂盒，特异地测定源于HbA1c糖化二肽，与HPLC法的测定结果进行对比分析以确定酶法测定糖化血红蛋白的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2013年1～6月本院内分泌门诊与住院确诊的糖尿病患者91例，诊断标准符合2010年ADA糖尿病标准化诊疗指南[4]。其中男55例，女36例，年龄37～75岁，平均55.1岁。排除贫血、低白蛋白血症等影响糖化血红蛋白测定的疾病。空腹静脉抽血2 mL，EDTA-K2抗凝。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 酶法 日立全自动生化分析仪7600-020，糖化血红蛋白测定试剂盒（二代酶法）、前处理液、校准品、质控品均由积水医疗科技（中国）有限公司提供。

1.2.2 离子交换高压液相色谱分析法 伯乐D-10糖化血红蛋白检测系统（HPLC法）、糖化血红蛋白检测试剂包及质控品由美国伯乐公司提供。

1.3 方法

1.3.1 酶法 将全血标本离心，离心速度800×g，5 min[5]。吸取25 μL红细胞加入500 μL前处理液，充分混匀后由日立全自动生化分析仪进行检测。

1.3.2 离子交换高压液相色谱分析法 全血混匀后依照伯乐公司提供的操作规程，利用D-10糖化血红蛋白检测系统进行检测。

1.4 统计学处理

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析。酶法和离子交换HPLC法的结果相关性采用线性回归分析，两组数据比较采用两样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线性分析

取一个高值样本稀释成如下比例（表1）：1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10、9/10、原倍。用两种方法同时检测后结果显示：酶法线性范围是2.5%～15.5%，R2=0.9920；离子交换HPLC法线性范围是3.8%～18.5%，R2=0.9987。

2.2 精密度分析

酶法和HPLC法分别用各自公司提供的高、低水平的质控品进行精密度测试。同一批分析利用两种方法测定质控品20次来确定批内精密度；每天测定一次，连续测定20 d来确定批间精密度。经计算得到酶法的批内精密度CV 1.09%，批间精密度CV 2.2%；离子交换HPLC法的批内精密度CV 1.17%，批间精密度CV 2.8%。

2.3 相关性分析

分别用酶法和HPLC法同时检测91例糖尿病患者的糖化血红蛋白，以酶法为y，以HPLC法为x作线性相关性分析。线性回归方程y=1.0137x-0.072，R2=0.9886（图1）。酶法测定的糖化血红蛋白结果与HPLC法差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

3 讨论

糖尿病是一种由胰岛素分泌缺乏或胰岛素抵抗或两者共同作用造成的以高血糖为特征的代谢性疾病[6]。糖尿病的慢性高血糖与各种组织的损伤脏器功能紊乱衰竭有关，特别是眼、肾脏、神经、心脏和血管。长期的高血糖可导致多种并发症的产生，尤其是病程长、病情控制差的糖尿病患者，后期往往会出现感染、糖尿病酮症酸中毒、糖尿病乳酸中毒、血管病变、神经病变[7]。因此，监测糖尿病患者的近期血糖水平尤为重要。糖化血红蛋白作为一个能反映患者2～3个月的血糖平均水平恰好符合这一要求[8]。2002年美国糖尿病协会已将其作为检测糖尿病血糖控制的“金标准”[9]。糖化血红蛋白是血红蛋白在体内与己糖发生缓慢的非酶促化学反应而形成的较为稳定的化合物，而真正与葡萄糖发生结合的血红蛋白为HbA1c，HbA1c由葡萄糖与HbA的β链缬氨酸残基缩合而成，先形成一种不稳定希夫碱，希夫碱解离或分子重排形成糖化血红蛋白。

目前实验室中检测糖化血红蛋白的常用方法有以下几种：乳胶免疫比浊法、电泳法、高效液相色谱法（HPLC）、离子交换凝微柱层析法、酶法[10]。乳胶免疫比浊法是利用单克隆抗体或多克隆抗体特异识别缬氨酸β链N-末端糖化的血红蛋白最后4～8个氨基酸组成的抗原表位进行分析测定，但是该方法的校准品得不到溯源，无法保证其准确性[11]。HPLC法作为检测糖化血红蛋白的参考方法具有良好的精密度和准确性，但是它检测成本高并且需要专用昂贵的仪器，不易在临床上推广。酶法是近年来发展的一种简便、快速、准确的方法[12]，它特异地测定源于HbA1c的糖化二肽，在特定的蛋白酶体系中与果糖基氨基酸反应，生成的过氧化氢使显色剂呈现颜色。在全自动生化分析仪上可以通过特定波长检测这种颜色度吸光度，吸光度的大小与颜色深浅成正比。endprint

王佑清等[13]在2012年报道酶法测定糖化血红蛋白的线性范围2.0%～16%，从本实验结果来看，线性范围与之接近。2010年ADA糖尿病标准化诊疗指南显示：糖尿病的诊断标准之一是糖化血红蛋白>6.5；糖尿病患者的糖化血红蛋白控制目标是<7.0。本实验室的酶法测定糖化血红蛋白的线性范围完全符合临床的要求。对于>15.5%的检测结果，可以在生化分析仪的参数里面直接设置稀释比例进行复查。

有临床组织颁布的指南建议将HbA1c是否下降0.5%来评判新的治疗方案是否有效[14]，这就要求实验室测定糖化血红蛋白时有更高的精密度，才能保证糖尿病患者治疗前后结果的可比性。酶法的精密度与检测系统的稳定性也有着密切的关系。全自动生化分析仪加样系统的准确性、光路系统的稳定性、清洗机构的清洗能力都会影响到酶法的精密度，应该定期对生化分析仪进行维护保养。另外酶法试剂装载到仪器上之后会一直敞口放置，接触空气会使其有效成分发生改变。当室温高于生化分析仪试剂仓的温度时，瓶口凝结的水珠会流入试剂瓶稀释试剂。当糖化血红蛋白检测完成时，可以把试剂拧紧盖子放入冰箱。通过以上几种方法使酶法测定糖化血红蛋白处于最佳变异状态，达到良好的精密度。本文的实验结果表明酶法的批内精密度CV 1.09%，批间精密度CV 2.2%，酶法的批内和批间精密度均优于HPLC法。

综上所述，酶法测定糖化血红蛋白精密度好，与HPLC法有良好的相关性，操作简便，值得在临床上推广使用。

[参考文献]

[1] Berge LI，Riise T，Hundal O，et al. Prevalence and characteristics of depressive disorders in type 1 diabetes[J]. BMC Res Notes，2013，6（1）：543.

[2] Becquemont L，Benattar-Zibi L，Bertin P，et al. National observatory on the therapeutic management in ambulatory care patients aged 65 and over， with type 2 diabetes， chronic pain or atrial fibrillation[J]. Therapie，2013，68（4）：265-283.

[3] Malathi L，Masthan KM，Balachander N，et al. Estimation of salivary amylase in diabetic patients and saliva as a diagnostic tool in early diabetic patients[J]. J Clin Diagn Res，2013，7（11）：2634-2636.

[4] 陈妍，刘建国，徐磊，等. 空腹血糖、餐后2h血糖及糖化血红蛋白对糖尿病的诊断价值[J]. 郑州大学学报（医学版），2012，47（4）：534-537.

[5] 李义龙，单战海，韩冰，等. 酶法糖化血红蛋白试剂盒方法学比对评价[J]. 中国实验诊断学，2010，14（8）：1336-1338.

[6] 张瑾. 联合用药治疗2型糖尿病的临床疗效分析[J]. 中国当代医药，2012，19（31）：184，186.

[7] 张莲文. 老年糖尿病慢性并发症及护理分析[J]. 临床合理用药杂志，2013，6（18）：140.

[8] 穆银玉，吴巧萍. Bio-Rad D10全自动糖化血红蛋白仪初步评价[J]. 中国现代医生，2010，48（26）：34-35，91.

[9] Wium C，Gulseth HL，Eriksen EF，et al. Characteristics of glucose metabolism in Nordic and South Asian subjects with type 2 diabetes[J]. PLoS One，2013，8（12）：e83983.

[10] Lerstad G，Brodin EE，Enga KF，et al. Hyperglycemia， assessed by HbA1c，and future risk of venous thromboembolism：the Tromso study[J]. J Thromb Haemost，2014.12（3）：313-319.

[11] 赵翠伶，王丽娟，王连英，等. 不同糖化血红蛋白检测方法在临床中的应用探讨[J]. 中国医刊，2013，48（8）：36.

[12] Keltanen T，Sajantila A，Valonen T，et al. Measuring postmortem glycated hemoglobin-A comparison of three methods[J]. Leg Med （Tokyo），2013，15（2）：72-78.

[13] 王佑清，喻飞，王生忠，等. 酶法测定糖化血红蛋白的临床应用[J]. 临床和实验医学杂志，2012，11（9）：715-716.

[14] 宋银丹，段勇. 糖化血红蛋白检测标准化的研究进展[J]. 实验与检验医学，2013，31（2）：108-110，130.

（收稿日期：2013-12-05）endprint

王佑清等[13]在2012年报道酶法测定糖化血红蛋白的线性范围2.0%～16%，从本实验结果来看，线性范围与之接近。2010年ADA糖尿病标准化诊疗指南显示：糖尿病的诊断标准之一是糖化血红蛋白>6.5；糖尿病患者的糖化血红蛋白控制目标是<7.0。本实验室的酶法测定糖化血红蛋白的线性范围完全符合临床的要求。对于>15.5%的检测结果，可以在生化分析仪的参数里面直接设置稀释比例进行复查。

有临床组织颁布的指南建议将HbA1c是否下降0.5%来评判新的治疗方案是否有效[14]，这就要求实验室测定糖化血红蛋白时有更高的精密度，才能保证糖尿病患者治疗前后结果的可比性。酶法的精密度与检测系统的稳定性也有着密切的关系。全自动生化分析仪加样系统的准确性、光路系统的稳定性、清洗机构的清洗能力都会影响到酶法的精密度，应该定期对生化分析仪进行维护保养。另外酶法试剂装载到仪器上之后会一直敞口放置，接触空气会使其有效成分发生改变。当室温高于生化分析仪试剂仓的温度时，瓶口凝结的水珠会流入试剂瓶稀释试剂。当糖化血红蛋白检测完成时，可以把试剂拧紧盖子放入冰箱。通过以上几种方法使酶法测定糖化血红蛋白处于最佳变异状态，达到良好的精密度。本文的实验结果表明酶法的批内精密度CV 1.09%，批间精密度CV 2.2%，酶法的批内和批间精密度均优于HPLC法。

综上所述，酶法测定糖化血红蛋白精密度好，与HPLC法有良好的相关性，操作简便，值得在临床上推广使用。

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[14] 宋银丹，段勇. 糖化血红蛋白检测标准化的研究进展[J]. 实验与检验医学，2013，31（2）：108-110，130.

（收稿日期：2013-12-05）endprint

王佑清等[13]在2012年报道酶法测定糖化血红蛋白的线性范围2.0%～16%，从本实验结果来看，线性范围与之接近。2010年ADA糖尿病标准化诊疗指南显示：糖尿病的诊断标准之一是糖化血红蛋白>6.5；糖尿病患者的糖化血红蛋白控制目标是<7.0。本实验室的酶法测定糖化血红蛋白的线性范围完全符合临床的要求。对于>15.5%的检测结果，可以在生化分析仪的参数里面直接设置稀释比例进行复查。

有临床组织颁布的指南建议将HbA1c是否下降0.5%来评判新的治疗方案是否有效[14]，这就要求实验室测定糖化血红蛋白时有更高的精密度，才能保证糖尿病患者治疗前后结果的可比性。酶法的精密度与检测系统的稳定性也有着密切的关系。全自动生化分析仪加样系统的准确性、光路系统的稳定性、清洗机构的清洗能力都会影响到酶法的精密度，应该定期对生化分析仪进行维护保养。另外酶法试剂装载到仪器上之后会一直敞口放置，接触空气会使其有效成分发生改变。当室温高于生化分析仪试剂仓的温度时，瓶口凝结的水珠会流入试剂瓶稀释试剂。当糖化血红蛋白检测完成时，可以把试剂拧紧盖子放入冰箱。通过以上几种方法使酶法测定糖化血红蛋白处于最佳变异状态，达到良好的精密度。本文的实验结果表明酶法的批内精密度CV 1.09%，批间精密度CV 2.2%，酶法的批内和批间精密度均优于HPLC法。

综上所述，酶法测定糖化血红蛋白精密度好，与HPLC法有良好的相关性，操作简便，值得在临床上推广使用。

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[8] 穆银玉，吴巧萍. Bio-Rad D10全自动糖化血红蛋白仪初步评价[J]. 中国现代医生，2010，48（26）：34-35，91.

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[11] 赵翠伶，王丽娟，王连英，等. 不同糖化血红蛋白检测方法在临床中的应用探讨[J]. 中国医刊，2013，48（8）：36.

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