HBeAg阳性慢性乙型肝炎外周血T淋巴细胞上CD28表达初步研究

齐青松++++++刘志华+++徐建明++++++钟培星++++++章小东

[摘要] 目的 分析HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞CD28表达特点。 方法 采集健康人、HBeAg阳性乙肝病毒携带者、HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的外周血，抗体标记，采用流式细胞技术检测CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD28+T细胞、CD8+CD28+T淋巴细胞，同时检测肝功能、HBVDNA。 结果 慢性乙型肝炎组、乙肝病毒携带组CD4+CD28+T细胞、CD8+CD28+T细胞、CD28+T细胞明显低于健康对照组（P<0.05）；高病毒载量组（HBVDNA≥107组）CD8+CD28+T细胞低于低病毒载量组（HBVDNA<107组）（P<0.05）。结论 所有结果显示乙型肝炎病毒持续感染状态与CD8+T细胞上共刺激分子CD28的表达低下有关， 而CD8+T细胞上CD28的低表达与高病毒载量有关。

[关键词] 乙型肝炎；T淋巴细胞；CD28

[中图分类号] R512.6+2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）09-0018-04

HBV感染后的转归依赖于人体免疫状态及其免疫应答，强有力的免疫反应针对病毒多种抗原产生特异性抗体最终清除病毒，而低下的免疫反应不仅不能控制病毒复制而且导致持续感染和疾病进展。CD8+T细胞作为主要效应细胞，在病毒清除中起重要作用[1，2]。而T细胞正常激活需要共刺激信号，CD28是T细胞上重要的共刺激分子，CD28对T细胞活化起关键作用[3]。尽管多种治疗的实施包括抗病毒药物的应用，最终能够清除病毒的慢性乙型肝炎病例较少，因此笔者分析慢性乙型肝炎患者外周血CD28分子在T淋巴细胞表达情况、并将乙肝感染者与健康人群比较、探讨乙肝感染慢性化的原因。

1 对象与方法

1.1研究对象

研究对象来自2012年7月～2013年8月广东医学院附属东莞市厚街医院传染科门诊及住院病区患者以及本院职工，从符合抗病毒标准[4]的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者中，知情同意后，抽取22例患者准备接受抗病毒治疗为A组，其中男13例，女9例，年龄21～45岁，平均（29.59±7.35）岁；另抽取21例HBeAg阳性慢性乙肝病毒携带者为B组，其中男13例，女8例，年龄20～45岁，平均（31.33±7.81）岁；本院HBsAg阴性的健康职工中抽取20例为C组，其中男12例，女8例，年龄21～42岁，平均（31.15±5.04）岁。排除标准：①6个月内使用过抗乙肝病毒、免疫抑制剂等药物；②同时感染甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、HIV；③伴有其他系统严重疾病（恶性肿瘤、严重心脏病、糖尿病等）或免疫性疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 主要试剂仪器 Anti-Human CD3 PE-Cy7、Anti-Human CD4 FITC、Anti-Human CD8 APC、Anti-Human CD28 PE购自美国ebioscience公司，BD-FACSCalibur II流式细胞分析仪。

1.2.2 细胞染色流式细胞仪检测分析 EDTA抗凝管抽取静脉3 mL，1500 rpm/min离心5 min后，3 mLD-Hanks液小心稀释沉淀，再次1500 rpm/min离心20 min后，小心将白膜层细胞吸出。D-Hanks液洗涤一次后，加入Anti-Human CD3 PE-Cy7、Anti-Human CD4 FITC、Anti-Human CD8 APC、Anti-Human CD28 PE抗体室温避光染色30min，然后2%小牛血清PBS洗涤2次后，BD-FACSCaliburⅡ流式细胞分析仪进行检测并进行结果分析。

1.2.3 HBVDNA、肝功能、乙肝六项、甲丙丁戊肝抗体、HIV抗体检测 HBV-DNA定量检测采用ABI7000检测仪，乙肝六项、甲丙丁戊肝抗体、HIV抗体检测采用ELISA方法进行，肝功能使用贝克曼DXC800自动化分析仪。

1.3统计学处理

应用SPSS13.0软件进行统计学分析，各组标准化的样本数值用（x±s）表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

所有检测数值为各T细胞亚群占CD3+T细胞百分比计算，CD3+T细胞代表总T淋巴细胞。

2.1 三组T细胞亚群比较

将A组（慢性乙型肝炎组）、B组（乙肝病毒携带组）、C组（健康对照组）年龄进行比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2相关指标比较

A组、B组CD4+T细胞百分率、CD4+T细胞/CD8+T细胞比值低于C组，差异有统计学意义（P<0.05），A组、B组CD8+T细胞百分率高于健康对照组，差异无统计学意义（P>0.05）；见表1。A组、B组CD28+T细胞、CD4+CD28+T细胞、CD8+CD28+T细胞百分率低于C组，差异有统计学意义（P<0.05），而A组、B组之间CD4+CD28+T细胞、CD8+CD28+T细胞百分率差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.3 不同病毒载量患者T细胞亚群比较

笔者按病毒载量HBVDNA≥107、HBVDNA<107分组比较，高拷贝组CD4+CD28+T细胞百分率低于低拷贝组，差异无统计学意义（P>0.05）；高拷贝组CD28+T细胞、CD8+CD28+T细胞百分率低于低拷贝组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.4 慢乙肝病人及健康人外周血T淋巴细胞亚群上CP28分子表达

以单个慢性乙型肝炎病人、乙肝携带者、健康人为例，采用流式细胞仪分析外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞亚群以及各亚群CD28分子表达情况。见图1～3。

3 讨论

乙肝病毒感染发病与清除机制尚未完全弄清，普遍认为与感染者免疫状态有关，CD4+T细胞为辅助性T细胞，CD8+T细胞是清除病原体的主要效应细胞，其中CTL（cytotoxix T lymphocyte，细胞毒性T淋巴细胞）在控制感染及清除病原体过程中起着关键作用[5、6]，CD8+CD28+T细胞就是CTL。

T细胞功能正常是以活化为前提的，它的激活必须经过双信号， 第一信号通过T细胞抗原受体识别并结合抗原递呈细胞表面的MHC（major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体）-抗原肽产生，第二信号通过T细胞上CD28与抗原递呈细胞上的B7分子结合产生[7]。近10余年，许多新的共刺激通路和共刺激分子被发现，双信号理论也得到不断完善，传统的CD28/B7通路仍然是最主要的共刺激通路，因此笔者对慢性乙型肝炎患者外周血T细胞上CD28表达情况进行研究。

本研究选取22例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者和21例乙肝病毒携带者，并选择20例本院健康职工为对照组，由于CD28表达随着年龄的增长而逐步下调[8]，笔者对三组年龄进行比较，差异无统计学意义，因而具有可比性。研究结果显示：①慢性乙型肝炎组、乙肝病毒携带组CD4+CD28+T细胞明显低于健康对照组，差异有统计学意义，与Arasli[9]、范振平[10]报道一致。有研究表明，CD4+T细胞对CD8+T细胞的增殖与活化具有重要调节作用[11]，CD4+T细胞自身同样需要活化，CD4+CD28+T细胞减少表明能被活化的CD4+T细胞减少，因而CD4+T细胞的调节作用受影响，必然在一定程度上影响到CD8+T细胞的增殖与活化。②慢性乙型肝炎组、乙肝病毒携带组CD8+CD28+T细胞低于健康对照组，差异有统计学意义，与范振平[10]、王沂芹[12]报道结果一致。因此，以上结果表明乙肝感染者CD4+CD28+T细胞、CD8+CD28+T细胞减少与乙肝感染持续状态有相关性。③慢性乙型肝炎组、乙肝病毒携带组CD4+CD28+T细胞、CD8+CD28+T细胞之间差异无统计学意义。理论上，慢性乙型肝炎处于免疫激活状态，乙肝病毒携处于免疫耐受状态，他们之间应该存在差异，本研究结果可能与样本含量有关，需要扩大样本量。不过，无论是慢性肝炎还是乙肝病毒携带者，最终能清除病毒的比例极少，显示两者免疫状态没有本质上的区别，可能是免疫耐受程度稍有差异。

另外，笔者将研究对象按照病毒载量高低分为HBVDNA≥107、HBVDNA<107两组，结果病毒载量越高，CD8+CD28+T细胞百分率越低，而CD4+CD28+T细胞百分率并不受HBV病毒载量的影响，提示HBV高复制与CD8+T细胞的CD28分子的低表达有相关性。不过，并非只有HBV感染出现CD8+T细胞上CD28分子的表达低下，HIV、EBV等病毒[13、14]也出现同样表现，结合目前实验结果，笔者推测，HBV特异性CTL长期暴露在大量抗原刺激，可能导致CD8+CD28+T细胞消耗性减少，因而表现为乙肝感染者CD8+T细胞上CD28分子的表达下调。但是，最近有研究发现[15]慢性乙型肝炎患者外周血游离CD28较健康人增多，结合慢性乙型肝炎患者CD8+CD28+T细胞减少这一现象是否暗示着：CD8+CD28+T细胞减少另外一个原因可能是CD8+CD28+T细胞上CD28+分子与之解离导致？这还需要进一步论证。

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（收稿日期：2013-12-09）

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（收稿日期：2013-12-09）