肺癌不同组织类型灰度值的比较研究

王虹蛟等

近年来，我国肺癌的发病率和死亡率均呈明显上升的趋势。研究发现，细胞周期失控是细胞增殖失控而导致癌变的重要原因。而细胞周期蛋白D1（cyclinD1）是近年来提出的重要的原癌基因，在细胞周期的调控中起关键作用。为了探讨细胞周期蛋白D1基因与肺癌的关系，本文进行了肺癌不同组织类型灰度值的比较研究。

1材料与方法

1.1研究对象

收集肺癌住院病人并经手术后病理证实的肺癌石蜡包埋组织108例。本实验组男75例、女33例，其中包括鳞癌59例、腺癌33例、小细胞未分化癌16例。

1.2实验方法

本实验用组织均经10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋。并且，每批实验都严格控制在相同条件下设免疫组化实验组、对照组。

免疫组化染色步骤：（1）石蜡组织5μm连续切片，每块切3片。（2）切片经逐级脱蜡至水洗。（3）3% H2O2室温孵育5～10分钟。（4）蒸馏水冲洗。（5）高压抗原修复（修复液为柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液）。（6）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。（7）10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，37℃孵育10分钟。（8）倾去血清，滴加1∶100稀释的一抗，4℃过夜。（9）PBS冲洗，3次，每次5分钟。（10）滴加生物素标记的二抗工作液（1∶200），室温30分钟。（11）PBS冲洗3次，每次5分钟。（12）滴加辣根酶标记的链酶卵白素工作液，室温30分钟。（13）PBS冲洗3次，每次5分钟。（14）滴加DAB显色液。（15）自来水充分冲洗，苏木精复染，封片。

图像分析仪测定：将每例免疫组化标本随机取一片，每片取3个视野。应用图像分析仪，分别测定所测区域的灰度值。

1.3实验结果判定

图像分析仪测定：以每片标本随机取3个视野，分别测定每个视野所测区域的灰度值，其灰度值計算公式Y=0.299R+0.587G+0.114B，最后取每例标本3个视野的灰度值的平均值为该标本的灰度值来进行统计学处理。此外在测定时，在相同的光度条件下，使用的玻片相同，标本切片厚度相同，经随机抽检20个样本的空白区域灰度值，其结果基本相等。空白区域灰度值变化小，实验误差很小，对所测样本无明显影响，可考虑不计。

1.4统计学方法

图像分析仪所测得cyclin D1灰度值采用两组资料的秩和检验方法。

2结果

2.1肺癌与正常肺组织灰度值比较

测定结果显示：所测肺癌组织的灰度值明显高于正常肺组织的灰度值，二者在统计学上有极显著性差异（P<0.01）。

2.2不同类型肺癌与正常肺组织灰度值比较

经测定NSCLC的灰度值明显高于正常肺组织，差异极显著（P<0.01），说明cyclin D1在肺鳞癌及腺癌中均过表达，而SCLC及正常肺组织中的灰度值明显降低，尤以后者为著，但二者之间差异无显著性（P>0.05）。

2.3不同分化程度鳞癌与正常肺组织灰度值比较

所测标本灰度值随着组织分化程度的增高而增大，在高分化中最高，低分化次之，在正常肺组织中最低。正常肺组织、未分化癌、低分化癌三者与高分化癌相比均差异极显著（P<0.01），未分化癌与低分化癌之间差异不显著。

2.4不同分化程度腺癌与正常肺组织灰度值比较

同鳞癌测定的结果基本相同，在腺癌中其灰度值随着组织分化程度的增高而升高，高分化癌最高，未分化癌最低，而正常肺组织均低于各不同分化程度的腺癌。高分化癌与未分化癌、低分化癌及正常肺组织之间有极显著性差异（P<0.01）。结果表明：在腺癌中其灰度值与肿瘤的分化程度呈正相关。因实验组中所选小细胞癌病例均为未分化型，故未进行统计学处理。

3讨论

近年来研究提示，细胞周期蛋白在细胞分裂过程中的作用机制如下：cyclin D1依据CDKS的激活，二者形成复合物，促使pRb丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化，释放出EZF、ELF等转录因子。EZF等转录因子又与多种基因的启动子结合，导致DNA复制，细胞呈现有丝分裂。cyclin D1基因是作用于G1期的主要周期蛋白，对细胞分裂有启动作用。有证据表明，cyclin D1基因转染入3T3细胞能导致细胞向肿瘤方向分化。肿瘤的发生是一个多步骤、多阶段的演进过程，与多抑癌基因的灭活和癌基因的激活有关。

为了探讨cyclin D1基因在肺癌中的表达情况及其与肿瘤生物学行为的关系，力求在进一步阐明肺癌的确切发病机理、早期诊断、临床病理参数及预防和治疗方面取得一些成果。本实验研究了108例肺癌石蜡包埋组织及10例正常肺组织中cyclin D1的表达，其结果表明，cyclin D1在肺癌中表达，而在正常肺组织中不表达。二者之间差异极显著（P<0.01）。提示cyclin D1只有在肿瘤组织中呈过表达状态，并且以往的cyclin D1的几种免疫组化研究已经在病理档案中石蜡包埋的癌组织中进行过，其结果也显示只有肿瘤细胞的cyclin D1表现出活性，因此说cyclin D1在肺癌的发生、发展中起到一定的作用。

通过实验进一步表明cyclin D1做为癌基因是毫无疑问的，它在肺癌的发生、发展中起着重要的作用。虽然有人将cyclinD1抗体微注射于正在分裂的细胞，则使它们停留在G1期，但是，cyclin D1抗体能否用于肿瘤治疗还有待于进一步研究，如果成功，则对于肿瘤的治疗将是一个重大的突破。

（编辑 凤池）