补体C5a对低氧脑损伤大鼠分泌IL-6的调节作用研究

周亚妮，李 可

(1.西安交通大学医学院，陕西西安710061;2.商洛职业技术学院，陕西 商洛726000)

缺氧是大脑中枢神经系统受损的重要因素，脑组织对氧气较为敏感[1]。适量低氧，机体可呈现生理性适应，而重度、中度低氧则会使机体发生病理性变化，导致炎症因子异常表达，异常表达的一些细胞因子可发生相互影响和调节。炎症是脑缺氧病理生理过程中的重要环节，在缺氧缺血性脑损伤中发挥重要作用[2]。目前多集中于大鼠在不同浓度的低氧及处理时间下所引发的脑损伤及分泌炎症递质IL－6的研究。而在大鼠缺氧脑损伤中，涉及分子免疫学方面的补体趋化因子C5a与炎症递质IL－6的相关研究较少。鉴于此，在诸多研究基础上，本研究观察了大鼠在重度(1%)、中度(4%)低氧环境下处理3 h后引发的炎症大鼠大脑皮质细胞产生的补体C5a对于IL－6分泌的调节作用，现将结果报道如下。

1 实验资料

1.1 实验动物 成年雄性SD大鼠54只，体质量(270±20)g，分为1%低氧建模组(A组)18只、4%低氧建模组(B组)18只和常氧量对照组(C组)18只。动物均购于西安交通大学医学院动物实验中心。

1.2 实验试剂 大鼠C5a ELISA抗体，2%B－27添加剂，Neurobasal培养基，1%青霉素－链霉素溶液，D－Hands液，磷酸盐酸缓冲液，PCR Master Mix，其他常用化学试剂。

1.3 实验器材 ELISA检测试剂盒，细胞培养箱，光学倒置显微镜，低氧工作站，96孔板。

1.4 方法

1.4.1 不同环境下分离、培养、收集雄性SD大鼠大脑皮质细胞 将54只大鼠分为 3组，每组18只。A组:在1%氧浓度的低氧工作站中放置3 h;B组:在4%氧浓度的低氧工作站中放置3 h;C组:常氧量(20%)状态下正常放置。不同氧浓度处理后，麻醉并固定于手术台上，无菌情况下分离出双侧大脑皮质，经剪碎、消化、过滤、离心后接种于细胞培养板中培养，按时换液，每个实验独立重复3次，后即刻收集大脑皮质细胞培养液，另外，需要收集上清液用于小鼠C5a蛋白水平检测。

1.4.2 低氧环境下大鼠大脑皮质细胞收集液中补体C5a的检测 C5a、IL－6检测严格依据细胞因子检测试剂盒说明操作。一抗(1～5 mg/L)溶解于包被液(碳酸盐缓冲液pH 9.6)，每孔100 μL包被ELISA亲和96孔板，4℃放置过夜后，10%FCS/PBS封闭1 h。PBS－T洗板3次，每孔加入100 μL样品，室温1 h，PBS－T洗板3次，加入Biotin化抗体(1～5 mg/L)，室温放置1 h，PBST 洗5次，加入 Avidin－HRP(1∶1000稀释，100 μL/孔)室温放置30 min，以 TMB 显色系统显色，测OD492或OD450值，分析补体C5a在大鼠低氧脑损伤中对IL－6分泌的影响。

2 结果

2.1 各组大鼠大脑皮质细胞收集液补体C5a及IL－6水平比较 A组、B组较C组C5a明显升高，IL－6降低。见表1。

表1 各组大鼠大脑细胞产生C5a及分泌IL－6情况比较(±s，ng/L)

表1 各组大鼠大脑细胞产生C5a及分泌IL－6情况比较(±s，ng/L)

注:①与 C 组比较，P ＜0.05。

项目 C组 B组 A组C5a 1.61 ±0.533.29 ±0.98① 12.35 ±2.68①IL －6332.49 ±15.64313.51 ±10.96① 155.57 ±1.83①

2.2 给予抗C5a单克隆抗体及外源性C5a后IL－6水平比较 给予等量抗C5a单克隆抗体后，C组、B组、A组IL－6水平分别为(294.15 ±12.03)ng/L、(225.87 ±11.61)ng/L、(69.58 ±3.67)ng/L，A组IL－6水平明显低于C组和B组(P均＜0.01)。给予外源性 C5a后，C组、B组、A组 IL－6水平分别为(336.41 ±14.12)ng/L、(337.35 ± 13.96)ng/L、(388.03 ±16.11)ng/L，A组水平明显高于B组和C组(P均＜0.01)。

3 讨论

IL－6是重要的细胞因子，而C5a是重要的炎症递质，在大鼠不同程度脑缺氧损伤中，有一定的消长关系，并参与免疫调节。Loddick等[3]研究表示，IL－6可诱导神经细胞分化，在缺血性脑损伤中发挥着神经保护作用。但Gorina等[4]研究显示，IL－6对神经细胞具有伤害性，可加重脑组织损伤。Wang等[5]以大鼠为模型，研究证实信号通路介导了缺血性低氧诱导的神经前体细胞向神经元方向分化的过程。

本研究结果表明，无论1%还是4%氧浓度环境处理大脑皮质细胞3 h后，对细胞表达IL－6均有诱导的趋势，这说明中低浓度缺氧对大脑皮质细胞表达IL－6起阻滞作用。李华华等[6]研究证实低氧对大鼠大脑皮质细胞表达 IL－6具有时间依赖性。Liu等[7]发现低氧可诱导颈动脉体表达 IL－6 mRNA，而随着时间延长，诱导作用更加明显。这提示无论缺血性低氧、缺血再灌注还是单纯一次性低氧都可诱导IL－6 mRNA 表达。Li等[8]发现间歇性低氧(5%，7.5%和 10%)和持续性低氧(10%)均可使大鼠血清中IL－6升高，提示低氧可促进IL－6蛋白表达。本研究结果与上述研究结果一致。

本研究还显示，给予C5a拮抗剂后，随着氧浓度的降低，IL－6的表达也降低，这说明C5a在小鼠缺氧脑损伤过程中参与了L－6表达的调节，且发挥着负性调控作用[9]。

本研究进一步明确IL－6在大鼠低氧脑损伤中的表达调节机制，并证明小鼠在低氧环境中大脑皮质细胞分泌的IL－6在一定程度上受C5a调控，在病理状态如低氧脑损伤过程中，异常表达则出现中性粒细胞趋化致其炎症反应的发生，那么C5a将得到活化，活化的C5a又可吸引具有C5a受体的小吞噬细胞之中的中性粒细胞游走到补体被趋化的部位[10]。可以推断，这个环节将有可能呈现恶性循环，继而加重脑组织损伤。也许在特定的调节环境中，其他的免疫因子或者细胞也参与并发挥作用，这有待于进一步通过动物实验对其探索和研究。目前关于低氧对炎症因子表达机制涉及了很多因素，如能将这些因素的归结点折射在某一点面上，那么对于探索缺氧性的脑损伤与炎症因子以及免疫分子之间的关联是一个新的途径，在临床缺氧性脑损伤治疗中，也是一个新的治疗思路，同时为寻求特异性的干预策略提供了新的实验依据。

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