中药超微粉腧穴敷贴对变应性鼻炎大鼠TGF-β1和IL-17含量影响的研究❋

陈 静，陈俊琦，黄 泳，张嘉玲，唐纯志

(1.南方医科大学中医药学院针灸推拿教研室，广州 510515; 2.南方医科大学第三附属医院康复医学科，广州 515630;3.广州中医药大学针灸推拿学院，广州 510405)

变应性鼻炎(Allergic Rhinitis，AR)又称过敏性鼻炎，是变应原激发由IgE介导的I型变态反应性疾病。一般认为，是Th1/Th2免疫反应失衡或免疫细胞向Th2细胞过度分化及鼻黏膜的高反应性引起的。但新的研究显示，CD4+T淋巴细胞应该分为Th1、Th2、Treg和Th17四大亚群[1,2]。

Treg细胞属于调节性T细胞(Thr)亚型之一，具有免疫抑制调节功能，主要分泌TGF-β1细胞因子。Th17主要介导炎症反应，研究表明IL-17与变应性炎性反应有重要的相关性[3～5]，其分泌的主要效应因子为白细胞介素17(Interleukin 17，IL-17)。调节性T细胞(Treg)和Th17细胞的发现以及相互间的关系，在更高层面为解释变应性鼻炎的发生提供了依据[6]。

腧穴敷贴法是在传统针灸医学基础上应用中药作用于腧穴，通过经络对机体的调整作用而达到预防和治疗疾病的一种中医外治法[7]。临床上被广泛应用于呼吸系统疾病的治疗，如慢性支气管炎、哮喘、变应性鼻炎等，并收到良好的临床疗效。本实验旨在观察中药超微粉腧穴敷贴对AR大鼠血清TGF-β1和IL-17含量的影响，以探讨其可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物

2月龄50只SD大鼠，雌雄各半(购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号0074460)，饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF级实验室，分笼置于室温18～22℃，12 h间断照明，自由进食水。按随机数字表法将实验动物分成正常对照组10只(雄5雌5)和造模组40只(雄20雌20)2组。动物适应性喂养3 d后进行造模，将造模成功的AD模型大鼠再随机分为即空白模型组(A组)、丙酸氟替卡松组(B组)、普通粉组(C组)和超微粉组(D组)4组，每组10只。

1.2 实验试剂

卵清蛋白(OVA，Sigma Chemical Co. P.O)；氢氧化铝Al(OH)3粉佐剂(天津市市福晨化学试剂厂)；Rat TGF-β1 ELISA Kit、Rat IL-17 ELISA Kit (武汉博士德生物工程公司)；丙酸氟替卡松(辅舒良)鼻喷雾剂(英国葛兰素史克有限公司)。

1.3 中药腧穴敷贴剂

普通粉(组成：白芥子粉、延胡索粉、细辛粉、甘遂粉)，批号080710，购于广州致信中药饮片有限公司；超微粉成分同普通粉，由广东省第二中医院药剂科粉碎成粒径范围0.1～75 μm，粒度分布中心D50≈10～15 μm，达300目以上的超微粉。所有中药均经过南方医科大学中药制剂教研室鉴定，药粉敷贴前均混合新鲜姜汁并调和均匀。

1.4 取穴

大鼠大椎、肺俞、肾俞定位参考《常用实验动物穴位定位》。大椎位于第7颈椎与第1胸椎间、背部正中，肺俞位于第3胸椎下两旁肋间，肾俞位于第2腰椎下两旁。

1.5 实验方法

1.5.1 模型制备 卵清蛋白(OVA)10 mg + Al(OH)3粉末30 mg + 生理盐水1ml制成混悬液，对造模组大鼠行腹腔内注射，隔日1次共7次，作为基础致敏。第15天进行加强免疫，给予5%OVA 50u1滴鼻/(侧/d)和1%OVA喷雾吸入5 min，连续7 d。正常对照组大鼠给予等量生理盐水代替进行腹腔注射、滴鼻及喷雾吸入刺激(方法同上)。

1.5.2 行为学计分 分别与治疗前后进行激发后30 min观察并记录大鼠搔鼻、喷嚏、鼻溢等行为。计数喷嚏个数：1～3个为1分，4～10个为2分，11个以上为3分；鼻涕留至鼻孔处为1分，过鼻孔为2分，流涕满面为3分；鼻痒轻擦鼻1～2次为1分，抓挠鼻、面不止，到处擦摩为2分。以上各项指标均采用叠加量化记分法，总分5分表示造模成功。经评定，造模组所有大鼠评分均超过5分，显示本组大鼠全部造模成功。

1.5.3 治疗方法 丙酸氟替卡松组(B组)：给予丙酸氟替卡松气雾剂喷鼻，每日1次，每次50 μg，连用10 d。普通粉组(C组)首先进行备皮，用眼科剪沿穴位周围剪毛，纵向范围是大椎至肾俞，横向范围是脊柱两侧各旁开1.5 cm。将按比例配置好的普通粉与新鲜姜汁调和均匀，制成0.5 cm×0.5 cm大小的药块，用3 cm×3 cm一次性纸胶布固定于穴位，再使用一次性透气孔胶布缠绕一圈以加固药贴。每次贴药4 h，连续10 d。超微粉组(D组)采用超微粉敷贴，方法同普通粉组。空白模型组(A组)给予生理盐水滴鼻，每日1次，连用10 d。正常对照组不采取任何处理措施。

1.5.4 外周血TGF-β1、IL-17水平检测 摘眼球法取大鼠外周血，将血液静置2 h，离心取上清液。根据酶标仪检测结果得到样品的吸光值，利用标准曲线的方程式计算得出待检样品中TGF-β1、IL-17的浓度(ng/ml)，稀释标准为1∶99。根据ELISA试剂盒说明书操作，按照标准曲线计算标本所测浓度。

1.5.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，血清TGF-β1、IL-17采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠外周血清TGF-β1的表达

表1显示，TGF-β1多重分析结果显示，A组血清TGF-β1含量较正常对照组大幅升高，提示造模成功；D组血清TGF-β1含量较A组、B组、C组显著下降(P<0.05)，与正常对照组比较差异有统计学意义(P=0.05)；B组血清TGF-β1含量较A组下降，差异有统计学意义(P<0.05)；C组血清TGF-β1含量较A组下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而B与C组之间比较差异无统计学意义(P=0.993)。综合分析结果提示，超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉均显著降低AR大鼠因过敏导致的血清TGF-β1异常升高，其中超微粉效果最好，而普通粉与丙酸氟替卡松效果相当。

2.2 各组大鼠外周血清IL-17的表达

表2显示，IL-17多重分析结果显示， A组大鼠血清IL-17含量较正常对照组大幅升高，提示造模成功；D组大鼠血清IL-17含量较A组、B组及C组显著下降(P<0.05)，与正常对照组比较差异无统计学意义(P=0.903)；B组大鼠血清IL-17含量较A组下降，差异有统计学意义(P<0.05)；C组大鼠血清IL-17含量较A组下降，差异有统计学意义(P<0.05)；B组大鼠血清IL-17含量较C组升高，差异有统计学意义(P=0.01)。综合分析结果提示，超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉均降低了AR大鼠因过敏导致的血清IL-17异常升高，其中超微粉效果最好，普通粉次之，丙酸氟替卡松稍差。

表1 AR大鼠外周血各组TGF-β1的表达(±s)

表1 AR大鼠外周血各组TGF-β1的表达(±s)

组 别正常对照组空白模型组(A组)超微粉组(D组)普通粉组(C组)丙酸氟替卡松组(B组)FPTGF-β1(ng/ml)10.08±3.66#21.30±4.14*#△★13.53±4.36*17.75±3.77*★17.77±3.07*△12.875<0.001

注：正常对照组与A组比较：#P<0.01；B组与A组比较：△P<0.05；D组与A组、B组、C组比较：*P<0.05；C组与A组比较：★P<0.05；C组与B组比较：☆P<0.05

表2 各组大鼠外周血清IL-17的表达(±s)

表2 各组大鼠外周血清IL-17的表达(±s)

组 别正常对照组空白模型组(A组)超微粉组(D组)普通粉组(C组)丙酸氟替卡松组(B组)FPIL-17(ng/ml)577.20±43.28#753.42±66.66*#△★574.26±48.53*627.98±56.96*★☆692.30±50.23*△☆20.676<0.001

注：正常对照组与A组比较：#P<0.01；B组与A组比较：△P<0.05；D组与A、B、C组比较：*P<0.05；C组与A组比较：★P<0.05；C组与B组比较：☆P<0.05

3 讨论

变应性鼻炎是常见的呼吸道变应性疾病，具有反复发作、迁延难愈的特点，全球平均发病率为10%～25%左右[8,9]。目前西医治疗以激素治疗、免疫脱敏疗法为主，但由于其实际疗效不确切、副作用明显等原因，仅有56%～58%的AR患者认为其治疗有效[9]，因此较多患者选择中医药疗法进行治疗。腧穴敷贴疗法是临床上广泛应用的中医药疗法之一，是集腧穴、药物两者作用于一体的独特治疗方法。临床证实，腧穴敷贴疗法对变应性疾病尤其是变应性鼻炎有独特疗效[10,11]。本实验采用《张氏医通》中记载的敷贴药方，将其制成有效组分溶出率和生物利用率均更高的中药超微粉，选取大椎、肺俞、肾俞进行腧穴敷贴治疗。

AR的发生涉及一系列炎症细胞(嗜酸粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞等)和众多的细胞因子、趋化因子、转录调节因子以及炎症递质，此外还存在神经调节、遗传学因素等作用[12]，机制尚未完全明确。虽然目前普遍认为变应性鼻炎与Th1和Th2失衡有关，但一些现象还不能完全用它来说明[13]。调节性T细胞(Treg)和Th17细胞的发现为解释AR的发生以及炎症程度起到了更好的补充。Treg细胞和Th17两者在分化过程中具有相关性，正常情况下，TGF-β诱导初始CD4+T细胞分化为Treg；当伴有感染或炎症时，IL-6和TGF-β共同启动初始CD4+T细胞向Th17分化，从而诱导以Th17为主的炎症应答[14]。虽然在分化上密切相关，但是在功能方面的研究表明，Thl7细胞的促炎症反应机制对介导免疫耐受的Treg 细胞有明显的拮抗作用[15,16]，当机体处于正常状态下两者保持平衡，但机体发生功能异常时常表现出Treg/Th17失衡，引起一系列炎症反应损伤机体。在研究与AR有类似发病机制的疾病(如哮喘、自身免疫性疾病、鼻息肉)时发现，Th17/Treg细胞比率的失衡都在它们的发病机制中起重要作用[17,18]。因此也有研究推断，Th17/Treg细胞的失衡与AR的发病机制密切相关[19]。

本实验结果显示，AR大鼠血清中TGF-β1和IL-17模型组较正常对照组均大幅升高，说明TGF-β1的表达增高促进了IL-17数量的增加，证实Veldhoen等[14]的实验结果，TGF-β在诱导初始T细胞分化为Thl7细胞中起着重要作用。TGF-β1 3组药物干预组与模型组比较差异有统计学意义，我们认为通过药物治疗使造模后升高的TGF-β1水平降低，这样促使TGF-β1免疫抑制能力的恢复，从而抑制淋巴细胞的增殖以及Th17细胞的分化。伴随着IL-17水平的降低，进一步控制AR的炎症程度。IL-17 3组药物干预组与模型组比较差异有统计学意义，以超微粉效果最好，说明3组药物均能有效降低IL-17的水平，从而降低炎症反应程度，进一步从动物实验验证临床上变应性鼻炎的病情轻重与Th17细胞转录因子及IL-17水平的高低呈正相关。

通过综合分析认为，本实验中TGF-β1参与Th17细胞的分化，这与大多数研究结果一致。此外，目前普遍认为TGF-β与Th17细胞在功能上互相拮抗。本实验中AR大鼠的TGF-β1与IL-17均升高，显示TGF-β1对IL-17起正向调控的作用，同时IL-17又反作用于TGF-β1，在功能上起拮抗作用，与Annunziato F、Evans HG等结果一致[20，21]。但由于不同物种、不同疾病之间有不同的变化，因此TGF-β1也起到不同的调节作用。临床及实验研究证实了这一点。查阅有关AR患者及动物实验的文献发现，外周血TGF- β1的结果很不一致，分别有增高、降低和无变化的结果报道。但无法否认的是，TGF-β1确实参与了Th17细胞的分化，其含量的升高与IL-17的升高成正相关，说明TGF-β1与Th17促炎症反应发生的程度有密切关系，两者在维持AR免疫稳态的过程中发挥着重要的作用。

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