褪黑素与“脾应长夏”理论的关系及机理初探❋

梁红娟,常瑞华,季新燕,王颖莉,王 燕,孙伟卫,曹慧慧,冯前进,刘亚明,李俊莲

(山西中医学院,太原 030024)

光-褪黑素(melatonin，MT)生物信号传导周期理论是一个很前沿的生物研究领域，MT的产生及昼夜分泌周期变化与外界日光照射存在着同步振荡协调的关系，且MT分泌的季节性变化与自然界气候变化同样存在同步振荡的关系[1]。一年中的冬季、早春、晚春、夏季、早秋、深秋测定山羊血清MT，早春和晚春、早秋和深秋的MT分泌水平也不一致[2]。这个理论为中医“天人相应”、“五脏应时”理论现代研究提出了一种链接的契合点。“脾应长夏”作为中医“五脏应时”理论的一个重要组成部分，认为人体五脏中“脾”的相关生命活动与长夏季节产生同步的协调变化，此时五脏由脾当令、由脾所主。如《灵枢·五音五味论》曰：“足太阴，脏脾，色黄，味甘，时季夏。”季夏为夏季最后1个月即长夏。课题组前期在MT与“心应夏”关系的研究中发现，MT与心钠素之间存在着一定的相关性[3]。本实验从MT随季节变化的角度出发，探讨内源性MT与长夏季节脾脏生理、病理模型的主要分子——胃泌素(gastrin，GAS)、胃动素(motilin，MTL)之间的关系，将取材点设为长夏正中之大暑当日，以便于更好地反映长夏季节的气候变化特点，为“脾应长夏”理论的现代研究提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠40只，体质量(180±20)g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物中心(合格证号SCXK(京)2009-0017)。

1.2 药物与试剂

大黄饮片(购自北京同仁堂药店，由亳州市京皖中药饮片厂生产，批号120201)，大鼠MT(批号E30014)、大鼠GAS(批号E30675)、大鼠MTL(批号E30375)的ELISA试剂盒(由美国R&D公司生产)，酚红(由天津市光复精细化工研究所生产，批号20111204)、氢氧化钠(由天津市天大化工实验厂生产，批号20110616)、羧甲基纤维素钠(由天津市光复精细化工研究所生产，批号20110920)等。

大黄水煎液制备方法：将大黄饮片浸泡20 min水煎，待沸后15 min，煎液3层纱布过滤，二煎煎沸15 min，过滤法同上，合并2次煎液，于旋转蒸发仪上浓缩成1 g/L水煎液，分装在小瓶中，4℃保存，室温下灌胃用。

1.3 主要仪器

KDC-1044低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，IKA-T25匀浆机(德国)，SPECTRAMAX 190全波长酶标仪(美国MD公司)，GZX-9076 MBE 电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，721型可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)。

2 方法

2.1 分组

将SD大鼠分成正常对照组、松果腺摘除手术组(手术组)、松果腺伪摘除手术组(假手术组)和脾气虚组共4组。每组10只，雌雄各半，自由取食饮水，适应性饲养1周(饲料为普通鼠全价颗粒饲料，购自山西医科大学实验动物中心)。

2.2 造模

正常对照组大鼠自由取食和饮水，不施加任何处理因素；手术组大鼠于大暑前30 d行松果腺摘除术[3,4]；假手术组大鼠于大暑前30 d行伪手术[3,4]；脾气虚组大鼠于大暑前21 d开始脾气虚模型复制[5]，造模以大黄法、游泳力竭法、饥饿法3种因素复合进行，每日上午以20 g/(kg·d)剂量灌服1 kg/L大黄水煎液，每日下午将动物负重(于大鼠尾根部缠绕质量为该大鼠体质量10%的铁丝)放入水深40 cm、水温20℃的水槽中游泳，以力竭为度(大鼠鼻尖没入水面10 s)，同时每日早8∶00给食、晚8∶00撤食。

2.3 标本采集

各组大鼠术前禁食12 h称重，每只大鼠用0.04%酚红糊(含l0%羧甲基纤维素钠)按照2 ml/只的量灌胃，20 min后乙醚麻醉后用毛细波管取眼眶血3 ml～5 ml，3000 r/min离心10 min，收集并分装血清和血浆，-70℃冰箱存放待检；后深麻醉处死动物，迅速开腹，结扎胃贲门和幽门，取胃置于15 ml的冷生理盐水中，沿胃大弯剪开，充分清洗胃内容物，取洗液5 ml，3000 r/min离心10 min，吸取3 ml加入1 mol/LNaOH溶液0.5 ml中，吸上清液用分光光度计于560 nm波长处比色，测其吸光度(A)，即为胃酚红A值，测0.04%酚红2 ml+生理盐水15 ml+1 mol/LNaOH0.5 ml溶液的A，即为基数酚红A值；取出小肠轻轻剥离后将其平铺于白纸上，测量幽门至酚红前沿的距离及幽门回盲部的小肠全长。

2.4 指标检测

2.4.1 各组大鼠体质量及脾气虚组大鼠游泳时间的测定 正常组、手术组、假手术组每周检测大鼠体质量，脾气虚组从造模第 1 天起，每日在灌胃前检测大鼠体质量，游泳时记录游泳时间。并随时观察泄泻、纳呆、形瘦、行动迟缓、被毛散乱竖起等情况变化，及时记录在已制定的观察表格中。

2.4.2 胃排空及小肠推进速度测定[6]以胃酚红残留率(胃酚红残留率=A胃酚红/A基数酚红×100% )评价胃排空速度；以小肠推进百分率(小肠推进百分率=移行距离/小肠全长×100%)评价小肠推进速度。

2.4.3 血清MT、血清GAS 及血浆MTL的检测 酶联免疫吸附法(ELISA)检测其血清MT、血清GAS和血浆MTL的含量，具体操作参照试剂盒说明书。

2.5 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，样本前后的变化采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，均数间的多组比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况

正常对照组大鼠在整个实验过程中精神良好，反应敏捷，行动有力，摄食正常，大便成形，被毛光泽紧密，体肌健壮。手术组与假手术组大鼠因手术原因，1周之内精神安静，反应迟缓，被毛光泽竖起，饮食基本正常，大便成形。1周后伤口愈合，精神变好，反应灵敏，行动有力，摄食正常，大便成形，被毛光亮紧密，体肌健壮。脾气虚组大鼠在造模前4 d其行为状态、活跃程度、情绪反应、皮肤毛发、饮食睡眠与大便状态等均未出现明显变化；第5天开始多数大鼠开始泄泻，多为便溏、肛周污秽，逐渐出现厌食、闭眼、畏寒、反应迟钝、皮毛不泽甚至枯槁，并有毛发疏散、竖立、体质量不增；第15天出现行动变缓，成群蜷缩，饮食减少，皮毛不顺，羸弱，游泳时间显著变短。

3.2 大鼠体质量变化及脾气虚组大鼠游泳时间变化

表1显示，与正常对照组比较，脾气虚组大鼠体质量明显下降(P<0.01)，第30天的体质量明显低于造模前体质量(P<0.01)，游泳时间也明显短于造模前游泳时间(P<0.01)，而手术组与假手术组体质量与对照组之间无明显差异。

表1 各组大鼠体质量的变化及脾气虚组大鼠游泳时间的变化(±s)

表1 各组大鼠体质量的变化及脾气虚组大鼠游泳时间的变化(±s)

组别例数第7天平均体质量(g/只)第30天平均体质量(g/只)第7天平均游泳时间(s/只)第30天平均游泳时间(s/只)正常对照组10229.50±24.39268.40±32.81 手术组10220.90±11.91270.10±40.36假手术组10220.20±11.96269.60±32.98脾气虚组10223.50±20.78186.80±27.09**△△8.70±6.222.80±3.51△△

注：与正常对照组比较：**P<0.01；与脾气虚组第7天比较：△△P<0.01

3.3 大鼠胃酚红残留率、小肠推进率、血清MT、血清GAS及血浆MTL的变化

表2显示，与正常对照组比较，脾气虚组大鼠胃酚红残留率高及小肠推进率降低(P<0.05)，血清MT(P<0.01)、血清GAS(P<0.01)及血浆MTL(P<0.01)的含量明显减小，说明脾气虚大鼠胃肠运动功能减弱，大鼠脾气虚能使血清MT、血清GAS及血浆MTL分泌减少；假手术组大鼠胃酚红残留率、小肠推进率、血清MT、血清GAS及血浆MTL均无明显差异，说明开颅术对胃肠运动功能、血清MT、血清GAS及血浆MTL的产生均无明显影响；手术组胃酚红残留率高及小肠推进率降低(P<0.05)，血清MT(P<0.01)、血清GAS(P<0.01)及血浆MTL(P<0.05)的含量减小，说明摘除大鼠松果腺后导致大鼠胃肠运动减弱，大鼠血清中MT、GAS及血浆中MLT的含量明显下降。与手术组比较，脾气虚组大鼠血清GAS的含量明显减小(P<0.05)，说明大鼠经造模后，胃肠道功能明显下降，对GAS的分泌产生了显著影响。与假手术组比较，手术组大鼠胃酚红残留率高及小肠推进率降低(P<0.05)，血清MT、血清GAS及血浆MTL的含量均减小(P<0.05)，说明松果腺摘除后可致大鼠胃肠运动减弱，大鼠血清中MT、GAS及血浆中MLT的含量下降。

表2 各组大鼠胃酚红残留率、小肠推进率、血清MT、血清GAS及血浆MTL的含量变化(±s)

表2 各组大鼠胃酚红残留率、小肠推进率、血清MT、血清GAS及血浆MTL的含量变化(±s)

组别例数胃酚红残留率(%)小肠推进百分率(%)MT(ng/L)GAS(ng/L)MTL(ng/L)正常对照组1051.20±21.6289.48±6.4342.09±3.50236.54±3.45267.61±5.61手术组1084.71±17.31*△83.39±5.52*△34.38±3.37**△235.69±2.19**△261.23±5.12*△假手术组1061.24±28.7789.77±6.9439.08±4.46236.68±2.93268.83±7.75脾气虚组1080.65±16.20*81.47±6.21*33.60±2.93**232.77±3.26**#260.30±4.03**

注：与正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较：△P<0.05；与手术组比较：#P<0.05

4 讨论

中医学认为，脾主运化，主升清，主四肢，为后天之本，气血生化之源。脾气虚弱，无力消化饮食水谷转化成水谷精微，不能转输到全身各脏腑，导致各脏腑器官失去濡养而出现全身消瘦、乏力、泄泻等症状。本实验采用3种复合方法建立脾气虚模型，运用饮食不节、攻下、过度游泳的手段使大鼠处于后天失养、泄泻、过度劳累的状态，最终使脾气受损。该方法与中医学脾气虚的病因基本一致。从实验中看到，脾气虚组大鼠体质量明显下降，游泳时间显著缩短，出现纳差、泄泻、蜷缩、毛发无泽等一系列症状，其胃排空速度延缓，小肠推进速度减慢，MTL和GAS分泌量下降，说明脾气虚模型建立成功。与以往文献报道结果一致[7,8]。

MT是由脑内松果腺分泌的神经内分泌激素，具有昼夜、季节性变化规律[9]。有学者经多年研究[10]认为，松果腺是五脏调控与五季关系的中介；松果腺随着季节变化而分泌不同含量的MT，可能是中医学五脏与五时相通应的主要调节点，是五脏调控机制的控制器。松果腺和其分泌的MT对雄性大鼠的肠道动力系统可产生一定的影响，具体作用机制尚待研究[11]。外源性MT可因剂量不同对胃肠运动起到双向调节的作用[12]。从本实验结果分析，MT含量与胃肠运动功能、MTL、GAS的含量存在一定的联系，这种联系表现为正相关，正常大鼠与脾气虚大鼠在长夏季节大暑当天分泌的MT与松果腺腺体分泌的MT具有一致性，可以推测脾气虚组血清GAS和血浆MTL的减少和胃肠运动功能的降低与大鼠血清MT的减少有关。摘除松果腺的手术组血清MT的减少可能引起GAS、MTL分泌减少和胃肠运动功能降低，即长夏季节，MT可能参与调控脾脏的生理功能，保护胃肠道的正常运动和GAS、MLT 2种胃肠道激素的正常分泌，抑或脾在长夏的功能正常与否关系着GAS、MTL的分泌及胃肠正常运动的发挥。GAS、MTL可能参与MT对胃肠道系统的调控过程，是光-MT信号调节消化系统活动的有关分子之一。

GAS、MTL均是脑肠肽，不仅分布在胃肠道中，也分布在中枢神经中。GAS可刺激胃酸、胃蛋白酶、促胰液素、胰酶等分泌，增强胃肠道的运动和胃黏膜的生长。MTL对消化间期的复合运动与胃肠道的运动、分泌都有强烈的作用。研究发现，中枢MTL对胃肠的作用是通过一种非肾上腺素非胆碱能神经元完成的，而迷走神经是其信号下传的通路[13]。由此推测，MT下降可能引起中枢神经冲动抑制，阻断胃肠激素信号在下丘脑-延髓-迷走神经的传导，非胆碱能非肾上腺素能神经元最终不能在胃肠道形成冲动，GAS、MLT的含量下降，从而导致胃肠平滑肌松弛、张力及蠕动减弱，胃排空时间延长，小肠运动减弱，胃肠运动异常，消化功能低下。

综上所述，MT与“脾应长夏”理论存在着一定相关性，MT与GAS、MTL之间存在正相关，正常大鼠与脾气虚大鼠在长夏季节大暑当天分泌的MT与松果腺腺体分泌MT具有一致性，说明MT分泌的季节性变化与自然界气候的变化存在一个同步振荡的关系[1]。这也是中医“天人相应”、“五脏应时”理论的物质基础。外周神经中的GAS、MTL含量与中枢神经中同一物质的作用机制及信号传导途径需要进一步研究。本实验认为，松果腺分泌的MT以及血清GAS、血浆MTL可作为“五脏应时”理论研究中的信号分子。

参考文献：

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