高压CO2对水酶法乳状液破乳影响的研究

韩宗元 江连洲 李 杨 齐宝坤 王中江 王胜男

（东北农业大学食品学院1，哈尔滨 150030）

（沈阳工学院生命工程学院2，抚顺 150030）

在水酶法提取大豆油脂过程中，乳状液破乳是十分关键的步骤，破乳越彻底大豆油的提取率越高。化学破乳主要是加破乳剂[1]。物理破乳包括静电场、微波、冷冻解冻、超声波破乳[2-5]。生物破乳主要是酶法破乳[6]。Nastaran等[1]提出吐温试剂作为高分子量化学破乳剂可以提高乳状液破乳率。Kuo等[7]指出微波产生的热量可以更快地去除水分，破坏电解质平衡，破乳率可达到90%。Wu等[6]利用不同酶对大豆乳状液进行破乳，比较各种酶的破乳效果。水酶法是一种绿色、环保的提油工艺，可以避免油脂提取过程中使用有机溶剂和有毒有害化学试剂。

高压CO2作为一种新兴的物理方法主要作用于蛋白沉降[8]。Nawal等[8]利用高压 CO2沉降大豆蛋白，使pH值降至3～5以加快蛋白沉降从而释放油脂[6]。Nael等[9]证明 CO2可以对油包水型乳状液进行破乳，增加CO2的压力和停留时间可以提高沉降速率，加速破乳过程。因此，高压CO2可以通过沉降乳状液中蛋白有效地进行破乳，而且作用时间短，效果明显。本研究目的：1）通过设计响应面优化试验对高压CO2压力、温度、处理时间、浓度进行优化，得到最优结果，将其应用到油脂破乳过程中，提高油脂提取率；2）通过透射电镜观察高压CO2破乳过程，掌握破乳前后乳状液变化情况，有助于高压CO2破乳参数的优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆：吉林风正食品有限公司；Protex6L碱性蛋白酶：诺维信公司；LDZ5-2型台式低速离心机：上海安亭科学仪器厂；pHS-3C型酸度计：上海雷磁仪器厂；CO2（纯度99.5%）：北京医疗设备二厂；耐高压不锈钢锅（1 200 mL）、数显温度调节计、数显压力调节计：上海一恒科学仪器有限公司；数显流量调节计：常州国华电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高压CO2破乳

大豆压片粉碎后过60目筛，将过筛后物料与水混合得到混合液，向混合液中加入Protex6L碱性蛋白酶进行酶解，酶解后5 000 r／min离心分离得到游离油、乳状液、水解液与残渣；提取乳状液与水解液并放入高压CO2耐高压不锈钢锅中，通入一定量CO2进行破乳，利用温度、压力和流量调节计控制参数。破乳后，在4 500 r／min下离心分离15 min后得到大豆油脂。

1.2.2 单因素试验

高压CO2温度150℃、浓度0.5 g／cm3、作用时间21 s、压力14 MPa。保证3个因素不变，只改变1个因素，通过研究CO2压力为8～20 MPa，蒸汽温度为120～190℃，蒸汽处理时间12～30 s，CO2浓度0.1～0.8 g／cm3确定各因素对破乳率的影响。

1.2.3 响应面优化试验

选取高压CO2温度、浓度、作用时间、压力4个因素为自变量，以破乳率为响应值，根据中心组合设计原理，设计响应面分析试验，见表1。

表1 因素水平编码表

1.2.4 破乳率的测定

检测方法及计算参考文献[6]。

破乳率＝破乳后油的质量（g）／乳状液中油的质量（g）×100%

1.2.5 透射电镜

前固定→漂洗→后固定→漂洗→50%乙醇脱水→70%乙醇脱水→90%乙醇脱水→100%乙醇脱水→100%乙醇和100%丙酮（1∶1）脱水→100%丙酮脱水→纯丙酮和包埋液浸透→包埋→聚合→修块→超薄切片机切片→染色→观察、拍片。

1.3 数据处理

所有试验数据均为“平均值±标准差”，n＝3。采用SAS9.18统计分析软件对试验数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 高压CO2破乳单因素条件对破乳率的影响

2.1.1 高压CO2温度对破乳率的影响

由图1可以看出，高压CO2温度高于130℃时破乳率明显增加，但当温度超过160℃时，破乳率开始大幅降低，可见温度对破乳率影响很大，因为CO2在130～160℃时，易溶于水，使pH降低，达到等电点，从而加快蛋白沉降，超过160℃时，CO2溶解度降低，导致蛋白沉降减慢使破乳率降低。因此蒸汽温度选择130～170℃。

图1 高压CO2温度对破乳率的影响

2.1.2 高压CO2浓度对破乳率的影响

由图2可以看出，浓度在0.5 g／cm3附近破乳率有最大值出现，浓度过高不利于 CO2溶解，导致蛋白沉降减慢，从而影响破乳率，所以选择浓度0.3～0.7 g／cm3。

图2 高压CO2浓度对破乳率的影响

2.1.3 高压CO2处理时间对破乳率的影响

由图3可以看出，当处理时间大于24 s时破乳率明显降低，因为通入过多CO2，导致CO2析出，降低蛋白沉降速率，所以在响应面试验设计中处理时间选择15～27 s。

图3 高压CO2作用时间对破乳率的影响

2.1.4 高压CO2压力对破乳率的影响

由图4可以看出，当压力为14 MPa时破乳率达到最大，因为溶解度和压力有关，压力过大使CO2溶解度降低，所以在响应面试验设计中压力选择10～18 MPa。

图4 高压CO2压力对破乳率的影响

2.2 高压CO2破乳条件的优化

应用响应面优化法进行过程优化，以x1、x2、x3、x4为自变量，以破乳率为响应值y，响应面试验方案及结果见表2。试验号1～24为析因试验，25～36为中心试验，用以估计试验误差。

表2 响应面试验方案及试验结果

2.3 响应面试验结果分析

通过统计分析软件SAS9.18进行数据分析，建立二次响应面回归模型。

回归分析与方差分析结果见表3，交互项显著的响应面分析见图5～图9。

表3 回归与方差分析结果

由表3可知，方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型回归显著（P＜0.000 1），失拟项不显著，并且该模型，说明该模型与试验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于该反应的理论推测。由F检验可以得到因子贡献率为：x4＞x1＞x3＞x2，即高压CO2压力＞高压CO2温度＞高压CO2作用时间＞高压CO2浓度。

当固定2个因素的零水平，图5～图9表示另外两个显著交互项的响应面和等高线。显著交互项可从表3获得，分别为：高压CO2的温度和浓度，高压CO2的温度和作用时间，高压CO2的温度和压力，高压CO2的浓度和时间，高压CO2的压力和时间。图5表明：当把x3和x4调节到零水平时，高压CO2的温度和浓度对破乳率影响的变化趋势都是先增加后减小。图6表示当把x2和x4调节到零水平，高压CO2的温度和作用时间对破乳率影响的变化趋势也都是先增加后减小。图7表明当把x2和x3调节到零水平，高压CO2的温度和压力对破乳率影响的变化趋势都是先保持稳定后减小。图8表示当把x1和x4调节到零水平，高压CO2的浓度和时间对破乳率影响的变化趋势是先增加后减小。图9表示当把x1和x2调节到零水平时，高压CO2的压力和时间对破乳率影响的变化趋势逐渐减小。

图5 高压CO2的温度和浓度的交互作用对破乳率的影响

图6 高压CO2的温度和作用时间的交互作用对破乳率的影响

图7 高压CO2的温度和压力的交互作用对破乳率的影响

图8 高压CO2的浓度和时间的交互作用对破乳率的影响

图9 高压CO2的压力和时间的交互作用对破乳率的影响

应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析，寻找最优响应结果：高压CO2压力13.96 MPa，高压CO2温度155.64℃，高压CO2处理时间21.46 s，CO2浓度0.53 g／cm3，响应面最优值（94.88±0.30）%。

2.4 验证试验与对比试验

在响应面分析法求得的最佳条件下，进行3次平行试验，破乳率的平均值为95.06%。破乳率预测值为（94.88±0.30）%，说明响应值的试验值与回归方程预测值吻合良好。

2.5 透射电镜分析

Wu等[6]研究指出水酶法提取大豆油脂过程中，破乳是关键步骤，而大豆乳状液中含有大豆蛋白，是保持乳状液稳定的重要成分，采用不同蛋白酶对其乳状液破乳，使油脂从蛋白包裹中释放出来。通过透射电镜观察，乳状液内部油脂被大量蛋白包围，无法聚合在一起释放出来，所以破乳是油脂释放的前提。图10a为破乳前乳状液中油脂和蛋白分布情况，可发现酶解后细胞壁被破坏，蛋白质大量聚集在一起，油滴被镶嵌在蛋白中，使油滴很难释放出来；图10b为乳状液经过高压CO2破乳后的分布情况，包裹油脂的蛋白膜大部分破碎、变小，而油体聚在一起形成油滴，小油滴变大，从包裹的蛋白中释放出来，并且聚集在一起[3]。通过透射电镜观察可以发现高压CO2可以破坏乳状液的稳定体系并有效地使油脂从乳状液中释放出来，进而解决了乳状液破乳的难题，最终提高了水酶法提取大豆油脂的提取率。

图10 乳状液破乳前后透射电镜对乳状液结构分析

2.6 物理破乳方法比较

通过比较表4中4种物理破乳方法对破乳率的作用，得到以下结果：高压CO2＞微波＞超声波＞冷冻解冻，说明高压CO2破乳法比其他物理破乳法的破乳率更高，作用时间短，可以更好地用于水酶法破乳，提高大豆油脂提取率[3-5]。

表4 4种不同破乳方法对破乳率影响

3 结论

本试验利用响应面分析方法对高压CO2破乳工艺参数进行了优化，得到最优参数条件：高压CO2压力为13.96 MPa，高压CO2温度为155.64℃，高压CO2处理时间 21.46 s，CO2浓度 0.53 g／cm3，响应面最优值（94.88±0.30）%。采用透射电镜，观察破乳前后乳状液中油和蛋白的分布情况，发现高压CO2可以使蛋白质沉降，进而使乳状液稳定结构瓦解，油脂正常释放，解决了水酶法提取大豆油脂的难题，有利于水酶法提取大豆油脂的工业化生产。

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