白术茯苓汤高中低剂量对脾虚型克罗恩病大鼠血清TNF—α和IL—1、IL—6的影响

钟强等

【摘要】目的：考察白术茯苓汤高中低剂量对脾虚型克罗恩病（CD）大鼠促炎因子的影响；初步探讨该方治疗脾虚CD的最佳有效剂量。方法：采用破气耗气加饥饱失常之复因脾虚造模方法结合Morris方法复制脾虚型CD大鼠动物模型，白术茯苓汤高中低剂量灌胃给药，酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）含量。结果：与空白组相比，模型组TNF-α、IL-1、 IL-6升高（P<0.05）；与模型组相比，高剂量组TNF-α、IL-1降低（P<0.05）；中剂量组TNF-α、IL-1、 IL-6降低（P<0.05）；低剂量组TNF-α降低（P<0.05）。结论：白术茯苓汤高中低剂量对脾虚型克罗恩病（CD）大鼠促炎因子的影响不同。其中白术茯苓汤中剂量组对TNF-α、IL-1、 IL-6的调节作用全面且优于高剂量组和低剂量组。

【关键词】白术茯苓汤；脾虚型克罗恩病；影响

【中图分类号】R222 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）04-0223-01

克罗恩病（Crohns disease， CD）是一种病因及发病机制尚未明確的慢性非特异性炎性肠病（IBD），病变主要影响结肠粘膜，且以溃疡为主。目前认为CD的发病是遗传和环境因素相互作用的结果，且与免疫功能异常密切相关。西医治疗主要使用水杨酸类、类固醇类和免疫抑制剂等以控制急性发作，缓解病情，减少并发症等，但疗效不稳定。迄今尚未有任何一种疗法被认为是治疗CD的特效疗法。现今，中医辨证论治以及中西医结合治疗对其有着较好疗效[1]。研究表明CD的病机特点为脾虚夹湿[2]。白术茯苓汤由白术、茯苓组成，具有健脾祛湿的功效。是治疗脾胃气虚证、脾虚湿滞证等的经典小方和常用药对[3]。本研究观察了白术茯苓汤高中低剂量对脾虚型CD大鼠血清TNF-α、IL-1、 IL-6水平的影响，探索白术茯苓汤高中低剂量调控脾虚型CD大鼠细胞因子的药效相关性，为中医方剂剂量配比理论提供一定的实验基础。

1材料与方法

1.1 动物

SPF级SD（Sprague Dawley）大鼠50只，由成都达硕生物科技有限公司提供，合格证号：SCXK（川）2008-11，雌雄各半，体重200±20g，检疫后备用。适应性饲养1周，自由摄食颗粒饲料，动物房温度维持在18-25℃左右。成都中医药大学基础医学院SPF级动物实验室进行，设施合格证：川实动管使第2003-015号。

1.2 药材与试剂

白术、茯苓、大黄、厚朴、枳实均购自同仁堂成都分店，经成都中医药大学制剂室鉴定为正品。

2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）购自Sigma公司，批号：P2297。进口分装肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）定量试剂盒（LOT：201106）、白介素-1（Interleukin-1，IL-1）定量试剂盒（LOT：201106）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）定量试剂盒（LOT：201106）由成都亚芯科技有限公司提供。

1.3 供试药物制备

1.3.1 中药汤剂的制备

称取药材，浸泡30min，共煎煮2次，每次30min，合并滤液，60℃恒温水浴浓缩至1g/ml，经0.45μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

1.3.1.1 小承气汤的配比

厚朴：枳实：大黄为3：3：2。

1.3.1.2 白术茯苓汤的高中低剂量

大鼠用药剂量按照国家中医药管理局的相关规定，人鼠单位体重用药量直接换算后的5、10、20倍为低、中、高剂量[4]。

1.3.2 TNBS灌肠液的制备

无水乙醇加双蒸馏水配成50%乙醇75ml，然后将5%TNBS10ml×15与50%乙醇（2：1=V：V）混合均匀，灭菌后装瓶4℃保存。

1.4 脾虚型CD动物模型制备

本实验采用破气耗气加饥饱失常之复因脾虚造模法[5]结合Morris方法[6]建立脾虚型CD动物模型。50只SD大鼠，全部雄性，按体重随机分为2批，10只常规饲养，为空白组，40只造模。空白组10只，常规饲养；40只造模大鼠采用小承气汤按20ml（kg/d），1次/d的剂量灌胃，加隔天禁食造成饥饱失常，连续14d，复制脾虚模型。并于造模第7d开始禁食不禁水24h，用2%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，予TNBS灌肠液1ml灌肠。灌肠器插入肛门约6cm-8cm，注入灌肠液1ml。大鼠头朝下体位，且灌肠器拔出后再继续保持1min左右，以防灌肠液流出。每隔5d重复灌肠1次，共5次。

1.5 实验分组及给药方法

造模结束后，造模大鼠随机分为1个模型组、白术茯苓汤高、中、低剂量组。空白组从实验开始至实验结束正常喂食、饮水；模型组灌胃等量0.9%生理盐水，1次/d，连续7d，白术茯苓汤高中低剂量组按10ml/kg灌胃，1次/d，连续5d。

1.6 标本采集与处理

各组实验大鼠在第38d禁食不禁水24h，股动脉取血处死。取血后不抗凝4℃静置保存2-3h，用离心机2500r/min离心15min，取上清液为待测样本。用ELISA法测定血清中TNF-α、IL-1、IL-6水平。

1.7 统计学方法

所有数据用SPSS13.0统计软件处理，组间计量资料比较采用单因素方差分析法，结果以均数±标准差（ X±s）表示，

2结果

2.1 脾虚型CD大鼠一般情况

造模后各组大鼠均出现腹泻、粘液脓血便、肛周大量糊状稀便黏附、食量减少、形体消瘦、毛发干枯、喜静爱扎堆。白术茯苓汤高中低剂量组经治疗后，高、低剂量组大鼠仍有少量稀便、粘液便、肛周糊有少量稀便；中剂量组大鼠大便基本恢复正常，肛周逐渐干净，体重增加。

2.2 各组大鼠血清细胞因子水平的变化比较（表1）

3 讨论

CD在中医学中尚无某一病名与之对应，根据其临床表现，常将其归属于“泄泻”、“肠澼”、“腹痛”、“痢疾”、“便血”等范畴。临床观察发现该病基本病机为脾虚夹湿。脾主运化，喜燥恶湿，脾虚气弱常既发水湿停滞的病变，若饮食不节或情志不遂等致脾胃损伤，脾不运湿，水湿停滞，湿浊下注肠道，则发为泄泻，正如《素问.藏气法时论》谓：“脾病者……虚则腹满，肠鸣飨泄，食不化。”湿滞肠间，搏结气血，气血运行不畅，血肉腐败，则见腹痛、便血等。脾虚夹湿是CD的基本病机之一，治当健脾祛湿。白术茯苓汤出自《古今医统大全》，为“治湿泻，又治食积、湿热作泻”之基础方。方中白术益气健脾兼能燥湿，茯苓淡渗利湿兼可健脾，二药相配，相须为用，既加强了益气健脾以助运化的作用，其燥湿渗湿作用又顾及了脾不运湿、湿浊下注之病变。在方剂学研究中，药对配伍是方剂配伍的基础，剂量配比是方剂研究的基础，因此本研究采用白术茯苓汤高中低剂量配比的实验设计，旨在探索白术茯苓这一基本药对的高中低剂量配比对脾虚型CD大鼠治疗的药效相关性。

西医学中CD为慢性肉芽肿性炎症，病变可累及胃肠道各部位，以回肠末端及其邻近结肠为主。其发生普遍认为与环境、感染、遗传以及免疫等多种因素综合作用所致[7]。TNF-α、IL-1、 IL-6等细胞因子已被公认是介导IBD发病的促炎因子，在IBD患者的结肠粘膜中，炎性細胞因子如IL-1β、TNF-α、 IL-6升高。本研究结果显示与正常组比较，脾虚型CD模型大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1、 IL-6水平明显升高（P<0.05），白术茯苓汤高中低剂量配比各组与模型组大鼠血清TNF-α、IL-1、 IL-6比较，高剂量组TNF-α、IL-1降低（P<0.05）；低剂量组TNF-α降低（P<0.05）；中剂量组TNF-α、IL-1、 IL-6降低（P<0.05）。

本次研究提示脾虚型CD大鼠血清中TNF-α、IL-1、 IL-6水平明显增高，而白术茯苓汤高中低剂量配比中，尤以中剂量组下调TNF-α、IL-1、 IL-6水平最为突出和均衡，提示茯苓白术汤剂量对脾虚型CD疗效的影响为非正比关系，当茯苓白术汤剂量逐渐增加至一定水平时，药物作用达到最佳，继续增加药物剂量，药物的作用反而会降低，以此印证在临床药效关系中，适当的药物剂量才会发挥最佳的治疗作用。

参考文献

[1] 严宁娟. 克罗恩病中西医研究进展 [D].北京：北京中医药大学，2007：31-35.

[2] 李乾构，周学文，单兆伟. 中华中医药学会内科脾胃病第十四次学术交流会论文汇编[C].山西，2002：2，3，264-266，270.

[3] 贾波，梁煜.补气健脾组方规律的文献及实验研究 [J].中国医药学报，2003，8（1）：35-37.

[4] 李仪奎，王钦茂.中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社，1991：61.

[5] 周永生，樊雅莉，陈小野，等.脾气虚证动物模型规范化的初步研究—部分免疫功能方面 [J].实验动物科学与管理，2003，20（2）：1-5.

[6] Morris GP， Beck PL， Herridge MS， et al. Hapten in-duced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon [J]， Gastroenterology，1989，96：795-803

[7] Hanauer SB. Inflammatory bowel disease： epidemio-logy，pathogenesis，and therapeutic opportunities [J]， Inflamm Bowel Dis，2006（12）：3-9.