实时定量PCR与痰涂片检查在结核病诊断中的应用价值研究

严艳红

【摘要】目的:研究实时定量PCR与痰涂片检查在肺结核诊断中的临床价值。方法:收集120份痰液标本，通过实时定量PCR与痰涂片同步检测，比较两组方法的阳性率、灵敏性和特异性。结果:本组80份确诊标本中涂片法阳性率为31.25%(25/80)，FQ-PCR法阳性率为68.75%(55/80)。涂片法的灵敏度和特异度分别为31.25%和95%，FQ-PCR法为68.75%和90%。结论:FQ-PCR法和涂片法在结核病的诊断中具有各自的优势，是结核病实验诊断的重要手段，应根据实际情况选择合适的检查方法。

【关键词】结核病；实时定量PCR；痰涂片

【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2014)06-0195-02

结核病的发病是由结核杆菌感染造成的，在世界范围内一直是威胁人类健康的一类传染病，近年来，由于环境污染、AIDS的传播和结核杆菌耐药性的提高，结核病的发病率呈上升趋势，对我国来说，结核病负担尤其重，因此各医疗组织积极研究和探讨结核病的早期诊断以及治疗方案，以达到控制病情的目的，本研究主要比较痰涂片检查和FQ-PCR荧光定量法在结核病诊断中的临床价值。

1材料与方法

1.1标本来源

120份供研究标本来源于我疾控中心结核病门诊部疑似结核病患者的晨痰标本，患者资料为男57例，女63例，年龄19~72岁。取0.5ml 痰标本加入2倍样本体积4%的NaOH，液化10min后15000r/min离心5min，去上清液；向沉淀中加入0.5ml 灭菌水，充分振荡混匀，15 000r/min离心2min，去上清液，重复洗涤3次；沉淀中加入50 ul DNA提取液(1%NP-40 +2%Triton X-100)，充分振荡混匀，100℃水浴10min；待冷却至室温，15 000r/min离心5min，取上清液备用。

1.2仪器与试剂

Heraeus低温冷冻离心机Megafuge 1.0R、Biospec-mini DNA/RNA/Protein analyzer(岛津)、7500荧光定量PCR扩增仪(Applied Biosystems)、凝胶成像系统(英国UVI tec)、结核分枝杆菌(TB)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)。

1.3检测方法

对临床送检的120份痰液标本，通过实时定量PCR与痰涂片同步检测。涂片法按照有关的实验操作规程进行，镜检显示每100个视野有3-9条抗酸杆菌为阳性［1］。FQ-PCR法按照试剂盒说明操作，以阴阳性质品控及阳性定量参考品的Ct值进行结果判定。

1.4统计学方法采用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析，两组间比较采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1涂片法与FQ-PCR法检查结果：涂片染色法阳性检出率为22.5%(27/120)，荧光定量PCR法阳性检出率49.17%(59/120)，显著高于抗酸染色法，漏检率低。对抗酸染色法阳性的样本，荧光定量PCR法的灵敏度分别为100%。

2.2本组120份标本共80份确诊为结核病，在确诊标本中涂片法阳性率为31.25%(25/80)，FQ-PCR法陽性率为68.75%(55/80)。

2.3灵敏性与特异性。涂片法的灵敏度和特异度分别为31.25%和95%，FQ-PCR法的灵敏度和特异度分别为68.75%和90%。

3 讨论

在以往的一段时期，对于结核病的实验室诊断方法一般是通过痰涂片检查和培养检查。痰涂片检测的优点在于能够发现结核 传染源，并且费用低，可以节省支出，操作较为方便，能够快速显示结果，然而缺点在于敏感性不理想，受痰标本杆菌浓度、实验操作人员技术水平和实验室条件影响较大，且无法辨别死菌还是活菌。在本研究80份确诊为结核病的标本中，涂片法阳性率为31.25%(25/80)。

在分子生物学研究突飞猛进的条件下，结核病的实验室诊断越来越多的采用PCR技术，本研究中即采用FQ-PCR荧光定量法来诊断结核病。研究发现PCR在结核病检查中存在定性技术特异性差 的问题，造成假阳性或假阴性等结果，而FQ-PCR荧光定量法很好的弥补了这一缺陷，且污染较小，自动化程度更高。FQ-PCR荧光定量法的原理在于利用一对结核分枝杆菌特异性引物和一条结核分枝杆菌特异性荧光探针，配以PCR反应液，耐热DNA聚合酶(Taq酶)，四种核苷酸单体(dNTPS)等成分，用体外扩增法检测结核分枝杆菌基因。该方法的检测对象是结核分枝杆菌基因保守片段，动态检测标本中结核杆菌DNA含量，不受细胞表型和耐药性影响，具有较高灵敏度和特异性［2］。本研究中的80份确诊为结核病的标本，经FQ-PCR法检查结果显示阳性率为68.75%(55/80)，与痰涂片检查比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

造成假阳性结果的原因分析：样品间的污染和扩増产物的污染、样品间的交叉污染最易发生在样品的处理过程之中。要避免扩增物的污染，理想的方法是缩短操作的时间， 简化操作手续并使用一次性离心管及带滤芯的枪头。造成假阴性的结果的原因分析：主要由于各种原因引起的酶活性降低、模板量太少、以及引物作用受到影响等三个方面的因素。本研宄所使用的试剂盒中采用了酶防污染系统，以降低各种因素对酶活性的影响。

总体来看，FQ-PCR法用于结核病诊断，其特异性和灵敏度明显高于涂片法，且操作简便，只需2 h～3 h就可以完成，对于结核病尤其是肺外结核的诊断具有较高的应用价值。而涂片法作为结核病最基本的细菌学检查方法，它所具有的直观、简便、价廉等优点，仍将是结核病实验室诊断的重要手段。

参考文献

［1］王怡云.痰涂片检查结核分枝杆菌规范化操作及改良安全抗酸染色法介绍［J］.卫生职业教育. 2009(23)

［2］肖慧霞,王晓平,王福锐,刘晓妮.荧光定量PCR技术在结核分枝杆菌检测中的应用［J］.宁夏医学杂志. 2011(02)