原发性肝癌患者微波消融治疗后外周血T淋巴细胞亚群的变化

阚 晓，潘家超，荆 燕，都晓伟，史兆章，韩绍磊，张海涛，郑昭敏

·肝癌·

原发性肝癌患者微波消融治疗后外周血T淋巴细胞亚群的变化

阚 晓，潘家超，荆 燕，都晓伟，史兆章，韩绍磊，张海涛，郑昭敏

目的观察原发性肝癌患者微波消融治疗前后外周血T淋巴细胞亚群的变化。方法152例原发性肝癌患者在微波消融治疗前1d、治疗后1 w和4 w，以流式细胞术检测患者外周血CD4+和CD8+淋巴细胞数量，采用全自动生化免疫分析仪检测甲胎蛋白水平。术后1 m进行肝脏CT增强扫描观察。结果在微波消融治疗后1 w和4 w，患者外周血CD4+T淋巴细胞上升至（26.5±3.8）%和（32.3±5.1）%，CD4+/CD8+比值上升至（1.12±0.43）和（1.51±0.40），而CD8+T淋巴细胞下降至（47.2±7.7）%和（28.1±7.3）%，与治疗前1d时基线水平[CD4+、CD8+和CD4+/CD8+分别为（21.4±4.1）%、（58.6±7.8）%和（0.98±0.45）]比，变化有统计学意义（P均＜0.05）；甲胎蛋白水平由基线水平[（1109±727）ng/ml]下降，术后1w和4w分别为（890±681）ng/ml和（215±18）ng/ml（P＜0.01）；微波消融后1m行增强CT检查，示病灶完全灭活率为97.4%(148/152)。结论微波消融治疗使原发性肝癌患者外周血T淋巴细胞亚群向CD4+T淋巴细胞优势转变，可能对治疗效果的取得发挥了作用。

原发性肝癌；淋巴细胞亚群；微波消融；CD4+/CD8+

原发性肝癌患者微波消融治疗后外周血T淋巴细胞亚群的变化

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）是我国常见的恶性肿瘤之一，约占全世界发病率的42%。我国肝癌年死亡率为20.4/10万，严重威胁人类健康[1]。微波消融（microwave ablation，MWA）已成为肝癌微创治疗的主要手段之一，尤其能延长中小肝癌患者的生存时间。MWA具有微创优势，并可诱导肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群的变化。本研究通过观察肝癌患者MWA治疗前后外周血CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞计数及甲胎蛋白（AFP）的变化，探讨MWA对PLC患者免疫功能的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集2010年2月至2012年3月我院住院并接受MWA治疗的PLC患者152例，男109例，女43例；年龄31～72岁，中位年龄51岁。其中肿瘤直径≤3 cm者123例，肿瘤直径3 cm～5 cm者29例。肝功能Child-Pugh A级96例、B级54例、C级2例；有肝硬化者132例；手术前血清AFP＞400 ng/ml者131例，＜400 ng/ml者17例，＜13.6 ng/ml者4例。纳入标准：无大血管浸润或肝外转移，每个病灶均能检测到血流，无门静脉癌栓或肝外转移，肿瘤直径≤5 cm，肿瘤结节≤3个，凝血功能基本正常。近半年未接受过免疫调节剂治疗。将患者分成MWA治疗组和对照组，两组在年龄、性别、体重指数、肿瘤结节等方面无显著性差异（P＞0.05）。

1.2 治疗方法治疗前所有患者均签署知情同意书。在超声（飞利浦iU22型彩色多普勒超声诊断仪，探头频率3.5MHz）引导下，用一次性医用薄膜包裹探头经皮肝穿刺行MWA[南京福中医疗高科有限公司生产的肝癌微波消融仪（METI-IV）]治疗[2]，输出功率50～90 W，微波穿刺针为MTC-180-2.0，配用蠕动泵作为水循环动力泵，冷却水用室温生理盐水（20℃～22℃）。根据肿瘤体积大小确定消融时间，其标准为：对瘤体直径≤3 cm者，治疗时间为5～8 min；对瘤体直径3 cm～5 cm者，治疗时间为8～15 min。对于一次消融不能覆盖肿瘤体积者，则采取移位穿刺点和重复手术法，直至肿瘤被全部消融。

1.3 淋巴细胞亚群检测采集EDTA-K2抗凝血2 ml，取100 μL，与10 μL抗CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP荧光抗体孵育15 min，加入溶血素2 ml，室温孵育10 min，见液体清澈透明后，1000 r/m离心5 min，弃上清。用2 ml PBS洗2次，弃上清后，加入0.5ml PBS悬浮细胞，在2 h内用流式细胞仪（美国BM公司生产的FACS Canto流式细胞仪，双激光六色）检测患者外周血T淋巴细胞亚群（三色荧光抗体CD4-FITC/CD8-PE/PerCR及溶血素均购自BD公司）。采用BDFACSDiva软件进行数据分析。

1.4 观察指标采用Ci8200全自动生化免疫仪检测血清AFP（美国雅培公司）；采用飞利浦16层螺旋CT-Brilliance16检查肝脏（上海博钰医疗器械有限公司）。

1.5 统计学处理应用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析和成组设计样本的t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 疗效情况本组患者随访至2012年7月，143例（94.08%）生存，9例死亡，其3 m、6 m和12 m生存率分别为100%、98.0%和94.1%。术前及术后1 m，行常规肝脏CT扫描，判断消融效果（图1）。典型病例术前及术后增强CT检查结果对比病灶消融灭活率为97.4%。

图1 A原发性肝癌术前增强CT

图1 B微波消融后1月增强CT

2.2 MWA治疗前后患者外周血CD4+、CD8+T细胞计数及AFP的变化见图2和表1。

图2 流式细胞仪检测患者外周血CD4+和CD8+T细胞计数

表1 152例患者治疗前后T细胞亚群（%）和AFP（±s）的变化

与治疗前比，①P＜0.05；②P＜0.01

3 讨论

PLC的5 a平均生存率只有7%左右[3]。MWA已成为肝癌微创治疗的主要方法之一[4]，并取得了良好的临床疗效。小肝癌患者经MWA治疗能达到根治性效果[5]。机体的免疫功能与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系。在肝癌患者中，T细胞功能受抑制主要表现为CD4+T细胞数量下降，CD4+/CD8+比值倒置，肿瘤患者的细胞免疫功能处于抑制状态[6，7]。AFP是肝癌细胞分泌的特征性蛋白标志，高水平的AFP对机体免疫系统有明显的抑制作用[8，9]。肝癌患者外周血T细胞数量与血清AFP浓度、肿块大小、临床分期和肿瘤恶性程度密切相关。

MWA治疗不仅直接使肿瘤细胞凝固坏死，原位彻底灭活肝癌组织，而且还能提高免疫细胞数量及其抗肿瘤功能，而手术切除肿瘤有可能直接或间接地抑制细胞免疫[10]。MWA能提高机体免疫功能，其机制为：①MWA减轻了患者的肿瘤负荷及相应的免疫抑制因子；②MWA在肿瘤局部造成了炎性环境，有利于抗原提呈细胞提取、加工肿瘤抗原，诱发抗肿瘤免疫；③MWA降低了免疫抑制因子的水平，肿瘤细胞分泌的可溶性IL-2受体（soluble interleukin-2 receptor，sIL-2R）能中和活化T淋巴细胞分泌IL-2，使肝癌患者IL-2水平降低；④MWA可刺激淋巴细胞活化，释放细胞因子，通过细胞因子网络调节作用，增强机体的免疫力[11]。Schueller等[12]研究发现，热疗通过加强肝癌细胞HSP70和HSP90的表达，能增加对肝细胞癌的免疫能力；⑤AFP具有免疫抑制作用，MWA后患者AFP明显下降，进一步解除了机体的免疫抑制。

彭齐荣[13]等人研究报道，MWA治疗后肝癌患者免疫功能增强，将对肝癌患者的预后起到重要作用。本研究中，经MWA治疗1w后患者CD4+T淋巴细胞数量开始升高，CD4+/CD8+细胞比值升高，抑制性CD8+T淋巴细胞数量降低，说明患者T细胞免疫功能从术后1w开始升高，4 w后机体的免疫功能明显升高，在MWA治疗后，上述变化能持续30 d以上[14]。MWA能够明显改善患者机体的免疫功能。电子显微镜观察发现，治疗后T淋巴细胞和巨噬细胞内的粗面内质网数量和巨噬细胞内的次级溶酶体数量明显增多，说明这些免疫细胞的功能明显增强[15]。对患者不同部位两个肝癌结节的MWA治疗对照研究表明，消融一个结节后，另一个结节内部免疫细胞浸润数量也增加，体积增大，而且与治疗结节内浸润的免疫细胞表型相同，产生同样的免疫应答反应[16]。宿主与肿瘤的关系是一种动态平衡，MWA打破了宿主与肿瘤之间的免疫动态平衡。经MWA治疗后，绝大多数患者AFP水平恢复至正常，患者的细胞免疫功能和抗肿瘤能力得到增强，刺激了机体发挥抗肿瘤作用。外周血T细胞亚群是反应机体细胞免疫状态的较好指标，检测PLC患者MWA术后外周血T淋巴细胞亚群水平，有助于了解患者的免疫状态，以进一步评估MWA的疗效，指导患者的综合治疗，判断患者预后。

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（收稿：2012-12-24）

（校对：陈从新）

Changes in peripheral T lymphocyte subsets in patients underwent microwave ablation for primary liver cancer

Kan Xiao，Pan Jiachao，Jing Yan，et al.
Infectious Disease Hospital，Shandong University，Jinan 250021，Shandong Province，China

ObjectiveTo investigate the changes of peripheral T lymphocyte subsets in patients with primary liver cancer（PLC）underwent microwave ablation.Method152 patients with PLC were recruited and received microwave ablation treatment.One day before，and 1 week and 4 weeks after the treatment，the distributions of peripheral T lymphocyte subsets were determined by flow cytometry，and serum levels of alpha fetoprotein were measured by a automatic biochemical immune analyzer.Contrast-enhanced CT scans were performed in all patients one month after the treatment.ResultsThe percentages of CD4+or CD8+T lymphocytes and the ratio of CD4+/CD8+in this series one day before the treatment were（21.4±4.1）%，（58.6±7.8）%and（0.98±0.45），respectively，while the percentages of CD4+T lymphocytes increased to（26.5±3.8）%and（32.3±5.1）%，and the CD4+/CD8+ratio increased to（1.12±0.43）and（1.51±0.40），but CD8+T lymphocytes decreased to（47.2±7.7）%and（28.1±7.3）%，respectively（P＜0.05）one week and 4 weeks after microwave ablation;serum alpha fetoprotein levels were significantly decreased from the baseline[（1109±727）ng/ml]to（890±681）ng/ml 1 week or（215±18）ng/ml 4 weeks after ablation（P＜0.01）；contrast-enhanced CT scans revealed a complete ablation rate of 97.37%（148/152）for tumors one month after therapy.ConclusionsMicrowave ablation for PLC shifts the distribution of peripheral blood T lymphocyte subsets toward a CD4+cells-favorite status，which might play a role in improving the efficacy of the therapy.

Hepatoma；Microwave ablation；T lymphocyte subsets

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.021

250021济南市山东大学附属济南市传染病医院介入科（阚晓，史兆章，韩绍磊，张海涛，郑昭敏）；检验室（荆燕）；医学院（潘家超）；山东省潍坊市昌乐县人民医院感染病科（都晓伟）

阚晓，40岁，医学硕士，副主任医师。主要从事肝癌诊断与治疗学研究。E-mail:jinankanxiao@sina.com

共同第一作者：潘家超男，25岁，硕士研究生

郑昭敏，E-mail:zhaominzheng6808@126.com