酒精性肝病患者血浆白细胞介素-21水平及重组IL-21对LX-2肝星状细胞增殖和活化的影响*

郝书理，张纪元，金 磊，孙 颖，李保森，冯国华，王福生，邹正升

·酒精性肝病·

酒精性肝病患者血浆白细胞介素-21水平及重组IL-21对LX-2肝星状细胞增殖和活化的影响*

郝书理，张纪元，金 磊，孙 颖，李保森，冯国华，王福生，邹正升

目的分析酒精性肝病患者血浆白细胞介素-21（IL-21）水平及重组IL-21体外对LX-2肝星状细胞增殖和活化的影响。方法采用ELISA法检测17例酒精性肝炎、51例酒精性肝硬化患者和20例健康人血浆IL-21水平；体外培养LX-2肝星状细胞，以IL-21（1ng/ml或10ng/ml）处理24 h或48 h，检测LX-2细胞增殖及α-平滑肌肌动蛋白表达。结果与健康对照人群比，酒精性肝炎和酒精性肝硬化患者血浆IL-21水平均显著升高（P＜0.05），但酒精性肝炎和肝硬化患者之间无显著性差异，不同Child分级的肝硬化患者之间也无显著性差异；在IL-21作用24～48 h后，LX-2细胞增殖水平与对照组比无显著性差异，但α-平滑肌肌动蛋白表达均较对照组显著升高。结论血浆IL-21可能通过促进肝星状细胞活化参与了酒精性肝病患者肝纤维化的发生和发展。

酒精性肝病；肝星状细胞；白细胞介素-21；细胞活化

酒精性肝病（Alcoholic liver diseases，ALD）是西方发达国家的常见病，我国嗜酒人群的比例也在不断升高。南方及中西部部分省份酒精性肝病流行病学调查资料显示，成人群体中ALD患病率为4.3%～6.5%。ALD占同期肝病住院患者的比例从1991年的4.2%增至1996年的21.3%。酒精性肝硬化在肝硬化病因中的构成比从1999年的10.8%上升至2003年的24%[1]。白细胞介素-21（Interleukin-21，IL-21）是2000年发现的“γ链家族”新成员，位于人类4号染色体，主要由活化的CD4+T细胞分泌，其中最主要的分泌细胞是Th17细胞及滤泡性辅助性T细胞（Tfh细胞）[2]。IL-21具有广泛的免疫调节作用[3，4]，主要包括对T细胞的调节作用、促进B细胞向浆细胞转化以及调节NK细胞的增殖和功能促进等。近年的研究提示，血浆IL-21与肝脏疾病的发生密切相关，IL-21在HBV清除中发挥关键作用[5]。在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血浆IL-21水平上调，且与肝病的严重程度密切相关[6]。本实验研究了ALD患者血浆IL-21水平变化，并初步探讨了IL-21在体外对肝星状细胞增殖和活化的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2013年4月～8月在我中心住院的酒精性肝炎患者17例，均为男性，酒精性肝硬化患者51例，均为男性，其中Child-Pugh A级21例，B级17例，C级13例。诊断依据“酒精性肝病诊疗指南”的标准[7]，排除HBV和HCV感染、药物性肝损伤、自身免疫性肝病和原发性肝癌。另选健康体检者20例，均为男性。本研究在我院伦理委员会备案，每位受试者签署知情同意书。研究人群的基线资料见表1。

表1 研究对象基线资料（±s）

表1 研究对象基线资料（±s）

①中性粒细胞/淋巴细胞比值；②Maddrey评分=4.6×[患者凝血酶原时间（s）—对照凝血酶原时间（s）]+血清胆红素（mg/dl）。＞32为重度酒精性肝炎和应用糖皮质激素治疗的参考阈值

1.2 实验材料和试剂除了藻红蛋白（PE）结合的抗人α-SMA（R&D，Minnesota，USA）以外，所有的抗体都购自BD Biosciences（San Jose，CA，USA）。重组人IL-21和检测IL-21的ELISA试剂盒来自eBioscience公司（Santiago，USA）。细胞计数检测试剂盒（Cell Counting Kit 8，CCK-8）购自日本同仁化学研究所，原理为WST-8[化学名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐]的中间代谢产物为黄色甲瓒产物，该产物的数量与活细胞的数量成正比，利用这一线性关系可以进行细胞增殖能力检测。

1.3 LX-2细胞增殖的检测将LX-2细胞【广泛应用的人肝星状细胞（HSC）系，购自北京大学药学部】[8]接种至24孔板，用含10%FBS的1640培养基培养，加入青霉素（100U/m1）和链霉素（100μg/m1），在37℃、含5%C02孵箱中培养，当贴壁细胞达到70%左右时，使用胰酶消化，传代培养。将LX-2细胞接种于96孔板，待细胞全部贴壁后，设不加（仅在培养基中培养的空白组）或加IL-21（1 ng/ml或10 ng/ml），使其终体积为200μl，孵育24 h和48 h。加入CCK-8溶液20 μl，37℃孵育1 h，在酶标仪450 nm处测定OD值。

1.4 LX-2细胞α-SMA表达的检测将传代的LX-2细胞接种于96孔板，待细胞贴壁，设不加（空白组）或加IL-21（1 ng/ml或10 ng/ml），孵育24 h和48 h，收集LX-2细胞于两个流式管中，每管约五万个细胞。将LX-2细胞用BD公司破膜剂破膜后，其中一管加入抗-α-SMA-PE 5 μl，另一管加入抗-IgG2a-PE 5μl，避光染色20 min，使用FACS Calibur和FlowJo软件（TreeStar，Ashland，OR，USA）进行检测和分析；另分别在刺激后的24 h和48 h，向检测孔中加入CCK-8溶液20 μl，37℃孵育1 h后，在酶联免疫检测仪450nm处测定OD值。

1.5 血清IL-21检测应用ELISA法检测。该ELISA试剂盒的最小检测浓度为15 pg/ml。批内和批间的变异系数分别＜5%和＜10%。所有样品均进行重复检测。1.6统计学处理采用SPSS 18.0版进行统计分析。多组之间使用Kruskal-Wallis H非参数检验进行比较，组间比较采用Mann-Whitney U检验。P＜0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组人群血浆IL-21水平比较ALD患者血浆IL-21水平较健康人明显升高（P＜0.001），酒精性肝炎和酒精性肝硬化患者血浆IL-21水平无明显差异（P＞0.05），不同Child-Pugh分级酒精性肝硬化患者血浆IL-21水平也无显著性差异（P＞0.05，图1）。

图1 各组人群血浆IL-21水平比较

2.2 IL-21在体外对LX-2细胞的影响在1 ng/ml和10 ng/ml IL-21作用下，与空白组比，LX-2细胞增殖无明显变化（P＞0.05）；在这两种浓度的IL-21作用24 h和48 h后，LX-2细胞α-SMA表达增强，说明IL-21可以明显促进LX-2细胞的活化（图2）。

图2 IL-21在体外对LX-2细胞的影响

3 讨论

最近，有很多报道提示IL-21在感染性疾病中发挥重要的作用[8～9]，且在HBV感染的动物模型中也起到一定的作用[10～15]。

当肝实质细胞受到损伤时，邻近的细胞通过旁分泌作用可分泌多种细胞因子作用于HSC，使之出现肌成纤维细胞样表型转化。当到达持续阶段时，HSC则会出现活化、增殖、趋化细胞聚集、纤维形成、细胞收缩、基质降解和维生素A消失等变化，进而导致肝纤维化的形成。LX-2细胞作为肝星状细胞的体外细胞系，可以表达α-SMA和波形蛋白[16～19]。因此，我们为探讨IL-21对LX-2细胞的作用，设置空白组和不同浓度的IL-21刺激组。所设单纯传代培养细胞不添加任何细胞因子的刺激，可视为静止期LX-2细胞，而加入了IL-21共培养的LX-2细胞分泌α-SMA增加（P＜0.05），我们即认为其已经活化。目前HSC活化增殖的免疫学因素尚不完全清楚。近期研究表明IL-21参与了一系列的炎症和促进纤维化过程[20～23]，但是IL-21在ALD患者中的作用却未见报道。因此，我们首先调查了IL-21在ALD患者血浆中的浓度，发现与健康人比较，ALD患者血浆IL-21水平明显增高，提示IL-21可能在ALD发病中发挥了重要作用。但是，它们在酒精性肝炎和酒精性肝硬化患者之间无统计学差异，造成这一结果的原因之一可能与本文两组病例数之间存在差别（17例酒精性肝炎，51例酒精性肝硬化）。我们在体外实验发现用IL-21刺激LX-2细胞，其增殖能力虽无明显改变，但其活化程度显著升高。这一结果提示IL-21在HSC的活化过程中发挥作用[24～25]，但作用的具体信号途径还有待于进一步研究。

本研究发现，ALD患者血浆IL-21水平明显升高，提示其可能在ALD发病中发挥着一定的作用，而IL-21可以促进肝HSC的活化，提示增加的IL-21可能通过激活HSC，进而加重肝脏的纤维化进程。

[1]王辉，王江滨.肝炎病毒感染与酒精性肝硬化关系的研究（附182例酒精性肝病临床病例报告）.白求恩医科大学学报，1998，24（6）：652-653.

[2]Ozaki K，Kikly K，Michalovich D，et al.Cloning of a type I cytokine receptor most related to the IL-2 receptor beta chain. Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（21）：11439-11444.

[3]Nakamoto N，Cho H，Shaked A，et al.Synergistic reversal of intrah-epaticHCV-specificCD8Tcellexhaustionby combined PD1/CTLA-4 blockade.PLoS Pathog，2009，5（2）：e1000313.

[4]Parrish-Novak J，Dillon SR，Nelson A，et al.Interleukin 21 and its receptor are involved in NK cell expansion and regulation of lymphocyte function.Nature，2000，408（6808）：57-63.

[5]Publicover J，Goodsell A，Nishimura S，et al.IL-21 is pivotal in determineing age-dependent effectiveness of immune responses in a mouse model of human hepatitis B.J Clin Invest，2011，121（3）：1154-1162.

[6]Hu X，Ma S，Huang X，et al.Interleukin-21 is upregulated in hepatitis B-related acute-on-chronic liver failure and associated with severity of liver disease.J Viral Hapat，2011，18（7）：348-367.

[7]中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.酒精性肝病诊疗指南.中华肝脏病杂志，2010，18（3）；167-171.

[8]Xu L，Hui AY，Albanis E，et al.Human hepatic stellate cell lines，LX-1 and LX-2：new tools for analysis of hepatic fibrosis.Gut，2005，54（1）：142-151.

[9]Iannello A，Boulassel MR，Samarani S，et al.Dynamics and consequences of IL-21 production in HIV-infected individuals：a longitudinal and cross-sectional study.J Immunol，2010，184（1）：114-126.

[10]Toomey JA，Gays F，Foster D，et al.Cytokine requirements for the growth and development of mouse NK cells in vitro.J Leukoc Biol，2003，74（2）：233-242.

[11]易本谊，江和，杨生晟，等.慢性乙型肝炎患者血清IL-21水平检测及意义.细胞与分子免疫学杂志，2009，25（12）：1167-1168.

[12]潘兴飞，张卡，杨小安.慢加急性肝衰竭患者外周血IL-21水平检测及其意义.中华实验和临床病毒学杂志，2012，26（6）：477-479.

[13]莫菁莲，王政.肝苏颗粒对慢性乙型肝炎患者IL-21的影响.中国实验方剂学杂志，2013，19（8）：284-286.

[14]尚雁君，胡志德，孙懿.原发性胆汁性肝硬化患者血清IL-21增高及其意义.中华检验医学杂志，2013，36（3）：222-227.

[15]潘庆春，余永胜，汤正好，等.慢性丙型肝炎患者血清IL-21水平检测及临床意义.中国临床药理学与治疗学，2013，18（2）：190-194.

[16]邹敏，李珉珉，李晓娟，等.不同治疗方案对慢性乙型肝炎患者血清白介素21水平的影响.2012，32（9）：1284-1286.

[17]Karimi MH，Hejr S，Geramizadeh B，et al.Study of the relationships between IL-23R，IL-17，IL-21 polymorphisms and serum level of IL-17，IL-21 with acute graft rejection in Iranian liver transplant recipients.Immunol Invest，2014，43（1）:69-85.

[18]王丽娜，鞠吉雨，梁淑娟，等.IL-21在肝癌细胞株H22细胞中的表达及其活性.中国肿瘤生物治疗杂志，2010，17（2）：174-178.

[19]Li L，Liu M，Cheng LW，et al.HBcAg-specific IL-21-producing CD4+T cells are associated with relative viral control in patients with chronic hepatitis B.Scand J Immunol，2013，78（5）:439-446.

[20]Ma SW，Huang X，Li YY，et al.High serum IL-21 levels after 12 weeks of antiviral therapy predict HBeAg seroconversion in chronic hepatitis B.J Hepatol，2012，56（4）:775-781.

[21]LasoFJ，Iglesias-OsmaC，CiudadJ，etal.Alcoholicliver cirrhosisisassociatedwithadecreasedexpressionofthe CD28 costimulatory molecule，a lower ability of T cells to bind exogenous IL-2，and increased soluble CD8 levels.Cytometry，2000，42（5）:290-295.

[22]McClain CJ，Cohen DA，Dinarello CA，et al.Serum interleukin-1（IL-1）activity in alcoholic hepatitis.Life Sci，1986，39（16）: 1479-1485.

[23]Petrasek J，Bala S，Csak T，et al.IL-1 receptor antagonist amelioratesinflammasome-dependentalcoholicsteatohepatitisin mice.J Clin Invest，2012，122（10）:3476-3489.

[24]邢微微，朱贺，龙民慧，等.重组人IL-22对大鼠酒精性肝炎的治疗效果评价.军事医学，2011，35（8）：607-610.

[25]余小虎，朱金水，邱夏地，等.还原型谷胱甘肽对酒精性肝炎患者血清TNF-A、瘦素的影响.实用肝脏病杂志，2005，8（3）：140-142.

（收稿：2013-10-14）

（校对：陈从新）

Plasma IL-21 levels in patients with alcoholic liver diseases and the effects of recombinant IL-21 on proliferation and activation of LX-2 hepatic stellate cells in vitro

Hao Shuli，Zhang Jiyuan，Jin Lei，et al.
Center for Diagnosis and Treatment of Non-infectious Liver Disease，302nd Hospital，Beijing 100039，China

ObjectiveTo evaluate plasma IL-21 levels in patients with alcoholic liver diseases and the effects of recombinant IL-21 on proliferation and activation of LX-2 hepatic stellate cells in vitro.MethodsThe plasma levels of IL-21 in patients with alcoholic hepatitis（n=17），patients with alcoholic liver cirrhosis（n=51），and healthy controls（n=20）were measured by ELISA；the LX-2 hepatic stellate cells were subjected to recombinant IL-21 at the concentration of 1 ng/ml or 10 ng/ml for 24 or 48 hours，then the cell proliferation and expression of α-smooth muscle actin were determined by CCK-8 and by FACs，respectively.ResultsPlasma levels of IL-21 were significantly elevated in patients with alcoholic hepatitis and cirrhosis as compared to that in healthy controls（P＜0.05），however，no significant difference was observed between patients with alcoholic hepatitis and patients with alcoholic cirrhosis，and no significant difference was found among cirrhotic patients with different Child class either；Incubation of LX-2 hepatic stellate cells with IL-21 at 1 ng/ml or 10 ng/ml for 24 or 48 hours did not affect cellproliferation，but significantly increased the expression of α-smooth muscle actin in the cells（P＜0.05）. ConclusionIL-21 might contribute to the fibrogenesis in alcoholic liver diseases though induction of activation of hepatic stellate cells.

Alcoholic liver disease；LX-2 cells；Liver fibrosis；Hepatic stellate cells；Interleukin-21

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.006

国家自然科学基金面上项目（81273249）

100039北京市北京大学医学部教学医院解放军第302医院非感染性肝病诊疗中心（郝书理，孙颖，李保森，邹正升）；肝病生物治疗研究中心（张纪元，金磊，冯国华，王福生）

郝书理，女，24岁，硕士研究生。E-mail：haoshuli302@163. com

邹正升，E-mail：zszou302@163.com