大鼠实验性牙周炎模型的快速建立*

蔡炜，张齐梅，贺晓萍，王忠朝，蒋俊强(泸州医学院附属口腔医院:口腔内科；修复科，四川泸州646000)

大鼠实验性牙周炎模型的快速建立*

蔡炜，张齐梅1，贺晓萍，王忠朝1，蒋俊强1
(泸州医学院附属口腔医院:口腔内科；1修复科，四川泸州646000)

目的:探讨如何快速建立大鼠实验性牙周炎模型，为开展牙周病的病因及防治的研究提供简便可靠的造模方法。方法: 20只5周龄SD大鼠，采取“牙龈划割+钢丝结扎+牙周炎患者细菌培养物冲洗+高糖饮食”的办法进行造模，在第2周末和第4周末观察牙龈炎症、牙周袋深度及牙松动度、牙槽骨吸收情况等指标，确认是否成功建模。结果:在第4周末实验牙牙槽骨吸收已深达根尖，其余指标也均显示成功建立了大鼠重度牙周炎模型。结论:使用该方法能够比较快速简便的构建大鼠重度牙周炎模型，从而有效模拟临床牙周炎发展进程，为牙周病的病因研究及临床防治提供依据。

大鼠；牙周炎；动物模型

牙周病是一种很常见、多发的导致牙周支持组织破坏的炎症性疾病，是导致成年人失牙的最主要原因[1]。据统计，牙周炎约占拔牙原因的30%～44%。对牙周炎的病因以及防治的研究一直是口腔临床科学研究的重点之一。牙周疾病的实验模型，对于了解牙周病在人体的起源和演变的病理至关重要，也是新的生物材料和治疗手段进入临床试验前的必要步骤。猴子、狗、兔子、大鼠、雪貂等动物是目前最主要的造模动物。但是由于大型动物造模受实验条件、社会伦理问题的限制，在大多数情况下，使用大鼠模型成为牙周病研究的一个热点[2]。建立快速简便、稳定可靠的牙周炎动物模型可以为牙周病病因研究提供科学可信的实验依据，对牙周炎的病因及防治的研究具有积极的意义。本文参照并综合了谢国秀、吴亚菲、程珏等学者[3-5]的牙周炎动物模型构造方法并加以改进，以望得到一种快速构建大鼠牙周炎动物模型的有效方法。

1 材料与方法

选取5周龄SD大鼠20只，体重220±20 g（泸州医学院实验动物中心提供）。30 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉、固定后，采用眼科弯剪对右侧上颌第二磨牙周围牙龈划割剥离。两天后再次麻醉大鼠后于该部位重复划割1次，采用正畸钢丝结扎右上第二磨牙牙颈部，钢丝尽量深入龈沟，并将结扎丝头部埋入牙龈。对临床重度牙周炎患者深牙周袋内细菌使用灭菌纸尖取样，将纸尖放入兼性厌氧转送管管底后接种于布氏血琼脂培养基（BRB）厌氧培养48 h。将细菌培养产物的稀释液0.5ml对实验大鼠口腔进行冲洗，隔日1次，连续3次。大鼠左侧磨牙不做特殊处理，作为自身对照。予以10%的白砂糖水和白砂糖水浸泡的软饲料对所有大鼠进行喂养。

实验2周后随机断颈处死5只大鼠进行牙龈指数、牙周袋深度、牙松动度、牙槽骨吸收量等指标的实验观察。在实验4周末随机采取5只大鼠右上颌第二磨牙龈下菌斑进行细菌培养和鉴定。并将全部大鼠全部处死后进行牙龈指数、牙周袋深度、牙松动度、牙槽骨吸收量等的实验观察以及组织病理学检查。

2 实验结果

2.1 一般情况

实验开始后1周内有3只大鼠死亡。其余大鼠开始出现躁动不安，食欲下降、毛色不顺等症状，随着实验的进展，逐渐变为萎靡不振，倦怠少动，食欲低下，皮毛纠结等症状。

实验开始3 d后出现大鼠右上第二磨牙牙龈红肿，探诊出血，逐渐发展为牙龈明显肿胀暗红，大量食物残渣存留，到实验结束前甚至出现大鼠实验牙牙龈自发性出血。

2.2 牙周袋深度变化

牙周袋深度：在实验第2周末进行检查，实验牙平均牙周袋深度为1.4mm，第4周末，实验牙平均牙周袋深度3.9mm。

2.3 磨牙松动情况

在实验开始的第2周末实验大鼠右上第二磨牙未出现明显松动，但到第4周实验结束，所有实验牙都已经发展到Ⅲ°松动。

2.4 牙槽骨吸收情况

牙槽骨吸收情况：将大鼠右侧上颌骨的牙龈及骨膜剔除干净，用0.2mol/LNaOH处理5min去除残留的软组织后自然风干，测量牙釉牙骨质界（CEJ）到牙槽嵴的距离。大鼠正常牙槽嵴顶位于釉牙骨质界下约0.3mm，作为正常自身对照的左侧牙槽骨在实验期间无明显改变。第2周末时，实验牙牙槽骨出现凹坑状吸收，平均嵴顶在釉牙骨质界下约1.2mm，而到第4周末，实验牙牙槽骨吸收均已深达根尖（见图1）。2.5病理学改变

组织病理学改变情况：分离实验区上颌骨，截取磨牙段，4%中性甲醛固定，EDTA脱钙，梯度酒精脱水，石蜡包埋。取第二磨牙切片（5μm），常规HE染色，光镜观察。见根尖牙槽骨破坏明显，牙周韧带不连续，呈现断裂、溶解破坏，周围有大量密集炎性细胞浸润(见图2)。

图1 左侧为对照牙牙槽骨情况，未见吸收；右侧显示第4周末实验牙牙槽骨吸收已深达根尖

图2 病理组织切片，见根尖骨质破坏，牙周韧带断裂，大量炎性细胞（HE×100）

2.6 细菌培养情况

细菌培养情况：在实验第四周末随机抽取5只大鼠进行牙周袋袋内细菌取样，并将对侧对照磨牙龈沟液取样，稀释后划种于非选择性的厌氧菌基础培养基（CDC）和伴放线杆菌（Aa）选择性培养基（TSBV）上，37℃厌氧培养72 h以上，挑取不同形态菌落，根据菌落、菌体特征、耐氧试验，部分加做生化反应作出鉴定。结果见表1。说明冲洗可以将重度牙周炎患者的牙周可疑致病菌顺利接种到大鼠口腔，并在造模形成的深牙周袋内检出。

表1 造模牙周袋和正常龈沟细菌培养情况

3 讨论

3.1 本造模方法的主要优点

目前报道的构建大鼠重度牙周炎模型的方法需要4周到8周不等[4-7]。本实验对已有造模方法进行综合和改进，期望能够更快构建该模型，但从最终效果来看，仍然需要4周的时间才能够造模成功，并不比已有方法更快捷。但本方法相对简单，同时建模效果相当稳定，应该是构建大鼠重度牙周炎模型的一种可供选择的方法。

现有方法包括单纯“局部因素”造模或“局部因素+全身因素”造模[8]，结合全身因素（如应用激素或免疫抑制剂等）造模的最大缺点在于周期较长、死亡率高、操作不方便、模型不稳定、个体差异大等，导致造模效果不是很确定。本实验采取了“划割+钢丝结扎+牙周炎患者细菌培养物冲洗+高糖饮食”的办法，综合应用了最主要的局部刺激因素造模，效果比较稳定。试验中采用钢丝结扎并将钢丝结头尽量深埋入龈沟，在整个实验进行中，没有出现结扎钢丝脱落的问题，这和丝线结扎容易脱落相比较是较好的办法[5]。总体上说，该造模方法还是比较方便有效的。3.2使用重度牙周炎患者菌斑样本的问题

单种或各种牙周致病菌的预防接种或注射可诱发牙周的病变[9]。但单一的细菌接种造模的效果比使用联合细菌要差[4]。本实验选用重度牙周炎患者的细菌样本培养物进行冲洗，是为了避免采用单一菌种冲洗的不足。最终在大鼠牙周炎龈沟细菌培养物检出多种牙周致病菌证实该办法能够比较方便有效的接种牙周致病菌。但其缺点在于无法精确控制接种的细菌种类。对于需要精确控制细菌的种类的实验来说，造模方法需要修改，对于不需要研究特定细菌对牙周炎构造的影响的实验，这种办法还是切实可行的。

1.曹采芳.牙周病学[M].第二版.北京:人民卫生出版社，2000:1～3.

2.Xavier Struillou，HervéBoutigny.Experimental Animal ModelsinPeriodontology:AReview[J].OpenDentJ，2010，4:37～47.

3.谢国秀，杨慎华，刘莉，等.大鼠实验性牙周炎模型简便方法的建立[J].中国比较医学杂志，2008，18（6）:60～62.

4.吴亚菲，赵筱芩，陈宇，等.不同方法建立大鼠实验性牙周炎模型的比较研究[J].四川大学学报(医学版)，2003，34(4):742～745.

5.程珏，李霞，孙克勤，等.不同方法构建大鼠实验性牙周炎模型的研究[J].中国药物与临床，2007，9:682～684.

6.苏军，刘鲁川，毛永利，等.SD大鼠牙周炎动物模型的建立[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2006，16(11):612～615.

7.GarantPR，ChoM I.Histopathogenesisofspontaneousperiodontal disease in conventional rats.II.U ltrastructural featuresof the inflamed subepithelialconnective tissue[J].JPeri-odontalRes，1979，14(4):310～22.

8.Peruzzo DC，BenattiBB，Antunes IB，etal.Chronic stress maymodulateperiodontaldisease:astudy in rats[J].JPeriodontol，2008，79(4):697～704.

9.Klausen B.M icrobiologicaland immunologicalaspectsofexperimentalperiodontaldisease in rats:a review article[J].J Periodontol，1991，62(1):59～73.

（2013-11-03收稿）

Rapid establishmentofperiodontitismodelin rats

CaiWei，ZhangQimei1，HeXiaoping，Wang Zhongchao1，Jiang Junqiang1
Department of Oral Internal Medicine；1Department of Prosthodontics，the Affiliated Stomatology Hospital of LuzhouMedicalCollege

Ob jective：Toestablish an experimental rodentmodelofperiodontitis for theunderstandingof the progression，prevention，and treatmentof the disease.Methods：20 five-week old rats received a gingival incision followed by steelwire suture，then inoculated with periodontitisbacterialsuspension and fed with a high-glucose diet. Several indexeswere recorded on the second and fourth week.Resuits:Thealveolarbone loss reached theapex of the rootby theend ofthe fourthweek.Other indexesalso indicated thatasevereperiodontitiswasestablished.Conclusion: Wehavesuccessfullyestablished asimplebutreliablemethod to imitatesevereperiodontitis in rats.Thismethod can be used to betterunderstand the progression ofperiodontitisand providea basis for further study on etiology，prevention and treatmentofperiodontitis.

Rats;Periodontitis;Animalmodel

R781.4

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2014.02.022

*四川省教育厅课题（09ZB129）

蔡炜（1980-），男，主治医师，硕士，E-mail:340-77696@qq.com

蒋俊强（1976-），男，副教授，硕士，E-mail:3961-88456@qq.com