miRNA398调控烟草Cu/Zn-SOD基因的表达

周小龙，魏春阳，黄 佳，史艳梅，王 皓，罗朝鹏，李 锋，王 燃*，杨 军，陈继峰，林福呈

1.郑州大学生命科学学院，郑州高新技术产业开发区科学大道100号 450001

2.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

3.中国烟叶公司，北京宣武区广安门外大街9号 100055

植物在正常生长条件下和逆境中均能产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），并产生一套复杂有效的系统来维持体内活性氧的平衡［1-2］。在正常生长条件下，植物细胞产生的活性氧能及时被自身的抗氧化系统清除，而当植物处于干旱、淹水、病害和紫外辐射等逆境中时，将导致细胞内大量活性氧的积累，若不及时清除会对细胞造成严重伤害。超氧自由基（O2-·）是活性氧中的一种，是叶绿体光合系统Ⅰ电子传递过程的产物，O2-·应及时在其合成的部位被清除以免产生危害更大的羟基自由基，完成这一任务的是Cu/Zn超氧化物歧化酶（Cu/Zn-Superoxide Diamutase,Cu/Zn-SOD），该酶和O2-·产生的位置均位于细胞叶绿体的类囊体上。Bowler等［3］的研究发现，氧化胁迫可以诱导Cu/Zn-SOD基因的表达来清除过多的O2-·。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）是生物体有效清除活性氧的重要抗氧化酶类［4］。Cu/Zn-SOD与植物的抗旱、抗盐碱、耐低温高温等多种抗逆性状密切相关［5］。miRNA是一类内源的、长约20~24个碱基的RNA分子，通过mRNA降解和翻译抑制等方式，特异地对靶基因进行转录后调控。miRNA调控Cu/Zn-SOD基因表达水平的研究源于模式植物拟南芥，有研究表明，Cu/Zn-SOD基因的表达水平取决于miRNA398水平［6］。当植物处于正常生长情况下Cu/Zn-SOD基因进行正常转录，但由于在miRNA398介导下的降解过程其转录产物并不累积，植物受到逆境胁迫（干旱）时miRNA398的表达受到抑制，导致Cu/Zn-SOD基因转录产物的积累，植物进而表现出抗氧化能力。转基因研究结果表明，miRNA398在调控Cu/Zn-SOD基因表达和逆境胁迫中发挥着重要作用［6］。烟草是一种重要的经济作物，其抗逆性尤其是抗旱能力受到普遍关注。烟草miRNA398是否具有调控其Cu/Zn-SOD基因表达的生物学功能，能否通过调控Cu/Zn-SOD基因的表达来实现对逆境胁迫的响应目前尚未见报道。因此，研究和比较了两个烟草品种在正常与逆境胁迫条件下miRNA398和Cu/Zn-SOD基因表达量的变化，并分析了miRNA398结合Cu/Zn-SOD基因的靶位点，旨在揭示烟草miRNA398的生物学功能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 烟苗培养

选用白肋烟B37和烤烟CB-1品种，采用l/3浓度的Hoagland完全营养液水培，具体操作参照田阳阳等的方法［7］。对照组按正常条件管理，干旱处理采用含20%PEG6000（质量体积比）的培养液水培处理2 d后取样。取样时烟株根系先用自来水冲洗，最后用去离子水冲洗干净。吸水纸吸干表面水分后分开根、茎和叶取样。液氮速冻后超低温冰箱中保存，用于RNA提取。

1.1.2 试剂和试剂盒

DNA聚合酶、DNA酶、PMD-19-sample-T载体、One Step PrimeScript®miRNA cDNA合成试剂盒、小RNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂SYBR Premix Ex Taq II和RNA反转录试剂盒均为日本Takara公司产品。

1.1.3 引物

根据烟草（Nicotiana tabacum）Cu/Zn-SOD的CDS保守序列设计引物，用于克隆基因全长编码区引物：上游引物P1 5’-ATGTCAACGGGACCAC-3’，下游引物P2 5’-TTAACCCTGGAGGCC-3’；用于mRNA荧光定量PCR扩增引物：上游引物P3 5’-ATGTCAACGGGACCAC-3’，下游引物P4 5’-TTAACCCTGGAGGCC-3’；miRNA 前体引物，上游引物P5为5’-TGTGTTCTCAGGTCGCCCCTG-3’，下游引物P6为小RNA提取试剂盒自带的Uni-miR定量PCR引物；荧光定量PCR内参基因Actin引物：上游引物5’-CTGGCATTGCAGATCGTATA-3’，下游引物5’-GCGCC ACCACCTTGA TCTT-3’。 除自带引物外，其他引物由宝生物工程有限公司商业合成，纯度为PAGE级。

1.2 试验方法

1.2.1 叶绿素含量的测定

参照曾建敏等［8］的方法测定叶绿素含量，并采用SPSS分析软件进行数据分析。

1.2.2 烟草小RNA和总RNA的提取

采用小RNA提取试剂盒提取烟草叶片小RNA，使用Trizol法提取总RNA。1.2.3 单链cDNA的合成

以所提取的RNA为模板反转录得到cDNA。按照RNA反转录试剂盒说明书，以Oligo（dT）18为引物合成总RNA的cDNA第一链。

1.2.4 定量PCR检测基因的表达

小RNA为模板反转录得到cDNA，分别以miRNA398和Actin引物进行定量PCR反应。反应体系为25μL：SYBR Green PCR Master Mix 12.5μL，miRNA398前体引物 P5（10μmol/L）和Uni-miR定量PCR引物（P6，10μmol/L）各1μL，cDNA模板2μL，灭菌水 8.5μL。反应程序：95 °C预变性3 min；95 °C变性15 s，58 °C退火20 s，72 °C延伸20 s，39个循环；72 °C 延伸10 min。每个PCR反应重复3次。内参基因Actin的PCR采用同样的程序。

总RNA为模板反转录得到cDNA，分别以Cu/Zn-SOD和Actin引物进行定量PCR反应。反应体系为20μL：SYBRPremix Ex Taq II 10μL，引物 P3和P4（10μmol/L）各1μL，cDNA模板2μL，灭菌水6μL。反应程序：95°C预变性3 min；95°C变性15 s，52°C退火20 s，72°C延伸20 s，39个循环；72°C延伸10 min。内参基因Actin的PCR采用同样的程序。每个待测样品cDNA设置3次重复,对得到的 3 个 Cp 值取平均值,用 2-ΔΔCp法计算［9］。

2 结果与分析

2.1 两个品种烟草叶片叶绿素的含量比较

经测定，白肋烟B37的总叶绿素含量比CB-1低（表1）。表1结果表明，CB-1干旱处理后叶绿素含量下降34%，而B37下降45%。同一品种干旱处理后的叶绿素含量比正常条件下降低，说明干旱导致烟草植株质体膜系统受损，引起叶绿体超微结构损伤，叶绿素降解，从而表现为叶绿素含量减少。因此，色素含量分析表明B37比CB-1更容易受到干旱胁迫的损伤。

表1 不同处理烟草样品中的叶绿素含量 （mg/g）

2.2 miRNA398的表达分析

对干旱和对照共4个样品得到的小RNA进行了miRNA398的表达量分析，荧光定量PCR的结果（图1）表明，烤烟CB-1经过干旱胁迫后，miRNA398的表达水平上调，而白肋烟B37经过干旱胁迫后，miRNA398的表达水平下降；且干旱胁迫后CB-1体内的miRNA398表达量显著高于B37，说明miRNA398参与了干旱胁迫的响应，且两个品种对干旱胁迫表现出正应答和负应答两种不同的响应方式。拟南芥受干旱胁迫后，通过miRNA398调控靶基因Cu/Zn-SOD清除植物细胞中活性氧，从而提高植物对逆境反应的耐受性［6］。因此，需要进一步验证两个品种烟草体内Cu/Zn-SOD基因表达的变化。B37体内miRNA398在干旱胁迫条件下表达量下降，可能会引起Cu/Zn-SOD基因表达量的进一步提高而应对逆境胁迫。CB-1体内miRNA398在干旱胁迫条件下表达量上升，因此Cu/Zn-SOD基因表达量可能下降，推测CB-1体内可能是其他的抗氧化机制在应对干旱胁迫，说明miRNA398在两个品种体内对相同胁迫产生了不同的响应。抗旱能力较弱的B37可能是通过低表达miRNA398而获得Cu/Zn-SOD基因的高表达来弥补其抗逆能力的不足。

图1 miRNA398在不同烟草品种中的相对表达量

2.3 Cu/Zn-SOD基因在不同样品中的相对表达情况

对4种处理的样品得到的总RNA进行了Cu/Zn-SOD的表达量分析，荧光定量PCR的结果（图2）表明，正常条件下B37体内的Cu/Zn-SOD表达量显著低于CB-1；在干旱胁迫条件下，B37体内miRNA398表达水平下调，造成靶基因Cu/Zn-SOD的表达量显著提高。Cu/Zn-SOD基因是胁迫信号的应答因子，在正常条件下，Cu/Zn-SOD作为一种抗氧化酶可以将有害的超氧自由基转化为过氧化氢，尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但植株体内的过氧化氢酶和过氧化物酶可以将其完全分解为水，使植物细胞内活性氧的产生与清除处于动态平衡［4］。干旱条件下叶绿素合成受阻，自由基含量上升，Cu/Zn-SOD表达量上升消除了自由基对植物细胞带来的损伤，叶绿素降解减缓，说明B37可能通过低表达miRNA398来提高Cu/Zn-SOD基因的表达量以弥补活性氧清除能力的不足；同时干旱胁迫条件下，miRNA398的表达量进一步下降，引起Cu/Zn-SOD基因表达量的进一步提高，从而增强了烟株的抗氧化能力来应对逆境胁迫。正常情况下，虽然Cu/Zn-SOD基因被转录，但由于miRNA398所介导的特异降解，Cu/Zn-SOD的mRNA并不积累。在干旱胁迫条件下，miRNA398的表达量降低，解除了对Cu/Zn-SOD基因的抑制，即Cu/Zn-SOD基因的mRNA表达量升高。有研究［6］显示，表达具有miR398抗性的Cu/Zn-SOD基因拟南芥突变体，Cu/Zn-SOD基因 mRNA表达量增高，其蛋白却没有增加，这表明miR398可能是通过抑制靶标的翻译进而对靶基因进行负调控。而CB-1在经过干旱处理后，miRNA398的表达水平上调，Cu/Zn-SOD基因的表达量降低，可能是其产生了更加复杂的抗氧化机制。

图2 Cu/Zn-SOD基因在不同烟草样品中的相对表达量

2.4 miRNA398和Cu/Zn-SOD基因的结合位点

在植物和动物发育过程中，miRNA和靶mRNA结合的程度和部位不同，会造成不同的作用方式。动物的miRNA多数与其靶mRNA的3′端非翻译区的识别位点以不完全互补的方式结合，以阻碍翻译机器对该mRNA的翻译来调控基因表达。绝大多数的植物miRNA与其靶mRNA的互补位点相似［10］。图3显示，烟草miR398与Cu/Zn-SOD基因的5′非翻译区（5′UTR）有16个碱基互补配对，说明miR398与Cu/Zn-SOD基因的作用位点（结合互补区域）位于该基因的5′UTR。

图3 miRNA398和Cu/Zn-SOD基因结合位点分析

3 结论和讨论

烟草miRNA398与Cu/Zn-SOD基因mRNA作用的位点在该基因的5′UTR区域，表明烟草miRNA398可能参与抑制Cu/Zn-SOD基因的表达。两个烟草品种miRNA398调控Cu/Zn-SOD基因表达对于干旱胁迫的响应不同，干旱胁迫条件下CB-1的miRNA398表达水平上升，B37的miRNA398表达水平下降，而对应CB-1的Cu/Zn-SOD基因表达水平下降，B37的Cu/Zn-SOD基因表达水平上升。对于烟草不同品种相同基因出现不同的表达模式，已有研究发现［11］14个烟草品种中Cu/Zn-SOD基因对于低温弱光胁迫的反应不同，表明其生物学功能在不同品种中可能发生了变化。但miRNA398调控Cu/Zn-SOD基因对逆境胁迫的响应机制尚需要更多的证据。

miRNA398通过介导Cu/Zn-SOD基因mRNA的降解，在多个不同胁迫中可能充当共同的应答元件［12］，与植物响应逆境胁迫密切相关；胁迫响应基因的表达多数受转录因子调控，同时在染色质水平、RNA水平和蛋白质水平也受到精细的调控［13］。如miRNA398是植物在铜素缺乏条件下介导铜素蛋白稳定的重要调控因子［14］。miRNA398家族包括miRNA398a，miRNA398b和miRNA398c，Yamasaki等［15］对拟南芥 miRNA398 进行顺式作用元件分析，在miRNA398b和miRNA398c的启动子区域分别发现了8个GTAC序列，而GTAC序列是生物体缺铜应答的必需元件。miRNA398的表达主要依赖于转录因子SPL7直接结合到miRNA398启动子区的GTAC序列。本研究推测miRNA398在两个烟草品种间存在不同的抗逆响应机制，因此，miRNA398的遗传学特征和转录调控机制尚有待进一步研究。

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