RP-HPLC法同时测定4种唇形科植物中3个苯乙醇苷的含量Δ

李茂星，尉丽力，陶锐，2，张超，邱建国，张泉龙（.兰州军区兰州总医院全军高原特殊环境损伤防治重点实验室，兰州 730050；2.兰州大学药学院，兰州 730000）

独一味[Lamioplomis rotata（Benth.）Kudo]为唇形科独一味属植物，以全草或根及根茎入药，具有活血止痛、化瘀止血之功效，用于治疗各种外科手术后的刀口疼痛、出血、外伤骨折等[1-2]。糙苏（Phlomis umbrosa）、螃蟹甲（P.younghusbandii Mukerjee）和萝卜秦艽（P.medicinalis Diels）为唇形科糙苏属植物，该属植物具有抗炎、免疫抑制、抗自由基突变及抗菌等生理活性，民间用于滋补强壮、跌打损伤、消肿祛痛等。化学成分研究表明，独一味、糙苏、螃蟹甲和萝卜秦艽这4种植物中都含有苯乙醇苷类成分[3-6]，该类成分具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增强记忆、保肝和强心等作用[7-9]，可能为这几种药用植物的有效成分。本试验以3个苯乙醇苷成分——acteoside、alyssonoside、isoacteoside作为含量测定指标，使用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时测定了独一味、糙苏、螃蟹甲和萝卜秦艽中3个苯乙醇苷的含量，希望可以为这几种药用植物的进一步开发和利用提供一些理论依据。

1 材料

1.1 仪器

HPLC仪，包括600型二元梯度泵、996型二极管阵列紫外检测器（美国Waters公司）；BP210 S型电子分析天平（德国Sartorius公司）；SK7200 H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试剂

acteoside、alyssonoside、isoacteoside对照品均为本试验室从螃蟹甲药材中分离得到，均经光谱学和波谱学鉴定其结构（见图1），经HPLC面积归一化法计算其纯度均在98%以上；乙腈为色谱纯，水为灭菌注射用水，其余试剂均为分析纯。

图1 3个苯乙醇苷类化合物的结构Fig 1 The structure of 3kinds of phenylethanoid glycosides

1.3 药材

独一味和糙苏药材于2010年7月分别采集于甘肃玛曲县和天水市，螃蟹甲和萝卜秦艽药材分别购于西藏林芝地区和青海果洛州，经兰州大学药学院马志刚教授鉴定均为真品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Symmetry C18（150mm×4.6mm，5μm）；流动相:乙腈（A）-水（用醋酸调pH为4.5），梯度洗脱（0～5min，14%A；＞5～10min，14%→20%A；＞10～25min，20%A）；流速:1.0ml/min；检测波长:330nm；柱温:20Ⅱ；进样量:10μl。在此色谱条件下，3个苯乙醇苷的峰形较好，与其他组分色谱峰可达基线分离。色谱见图2。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 准确称取干燥至恒质量的acteoside、alyssonoside、isoacteoside对照品各25mg，分别置25ml量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，即得对照品贮备液，用铝箔作避光保护，4Ⅱ冰箱里贮藏。检测前将各对照品贮备液配制成不同质量浓度的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取4种药材各适量，粉碎（过四号筛），分别准确称取1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25ml，称定质量，超声处理（功率:350W，频率:59kHz）30min，冷却，再称定质量，加70%甲醇补足减失的质量，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

图2 高效液相色谱图A.混合对照品；B.独一味地上部分；C.独一味地下部分；D.糙苏地上部分；E.糙苏地下部分；F.螃蟹甲地下部分；G.萝卜秦艽地下部分；1.acteoside；2.alyssonoside；3.isoacteosideFig 2 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.aerial parts of L.rotata；C.inferior parts of L.rotata；D.aerial parts of P.umbrosa；E.inferior parts of P.umbrosa；F.inferior parts of P.younghusbandii；G.inferior parts of P.medicinalis；1.acteoside；2.alyssonoside；3.isoacteoside

2.3 标准曲线的制备

取“2.2.1”项下各质量浓度的混合对照品溶液适量，按上述色谱条件进样分析。以质量浓度（x）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到3个苯乙醇苷成分的线性回归方程、线性范围和相关系数（r），详见表1。当信噪比为3时，得到各成分的检出限，详见表1。

表1 线性回归方程及检出限Tab 1 Linear regression equation and detection limits

2.4 精密度试验

取混合对照品溶液适量，按上述色谱条件重复进样测定6次，记录峰面积。结果显示，acteoside、alyssonoside、isoacteoside的RSD分别为1.75%、3.44%、2.45%（n均为6），表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

取螃蟹甲药材粉末适量，共6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，计算样品含量。结果显示，acteoside、alyssonoside、isoacteoside的平均含量分别为3.20、1.12、1.42mg/g，RSD分别为1.49%、3.16%、4.52%（n均为6），表明本方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液适量，分别于0、1、2、4、8、12、24h按上述色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，acteoside、alyssonoside、isoacteoside的 RSD 分别为 1.83%、2.86%、2.90%（n均为7），表明供试品溶液在24h内稳定。

2.7 加样回收率试验

精密称取适量已知含量的螃蟹甲药材粉末，共6份，分别精密加入一定量的acteoside、alyssonoside、isoacteoside对照品，使药材中的acteoside、alyssonoside、isoacteoside分别与加入各自对照品的质量比约为1∶1，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 样品含量测定

取独一味、糙苏、螃蟹甲、萝卜秦艽药材（地上/地下部分）粉末各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，以峰面积计算药材中acteoside、alyssonoside、isoacteoside的含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 流动相的选择

上述3个苯乙醇苷结构相似、极性较大，因此流动相的极性对其分离的影响很大。本试验考察了不同比例的乙腈-水、甲醇-水系统作为流动相的效果，发现采用乙腈-水梯度洗脱、用醋酸调pH为4.5时，分离度较好。

3.2 检测波长的选择

将上述3个苯乙醇苷分别作紫外光谱扫描，发现它们在330nm波长处均有最大吸收，故选择330nm作为检测波长。

表3 样品中3个苯乙醇苷的含量测定结果（n＝3）Tab 3 Content determination of 3 phenylethanoid glycosides in samples（n＝3）

3.3 小结

本试验结果表明，独一味、糙苏、螃蟹甲、萝卜秦艽4种药材中3个苯乙醇苷的含量各不相同，即使同一药材不同部位中3个成分的含量也各异。独一味地上部分中acteoside、alyssonoside、isoacteoside的含量比其他药材均高；萝卜秦艽地下部分中acteoside、isoacteoside的含量相较于其他药材均低；糙苏地上部分中alyssonoside的含量较其他药材均低。这是因为不同药材的习性各异、生长环境不同，造成acteoside、alyssonoside、isoacteoside的含量差异较大。3个苯乙醇苷成分总含量最高的为独一味地上部分，达到了64.84mg/g，接下来依次为独一味地下部分（8.18mg/g）、螃蟹甲地下部分（5.74mg/g）、糙苏地上部分（5.59mg/g）、糙苏地下部分（5.05mg/g），而萝卜秦艽地下部分的总含量最低，为2.91mg/g。同一种药材地上部分和地下部分3个苯乙醇苷成分总含量的高低差异还有待收集更多样品进行比较。

综上，本方法简便、准确、重复性好，可以同时测定4种唇形科植物独一味、糙苏、螃蟹甲和萝卜秦艽中3个苯乙醇苷成分——acteoside、alyssonoside、isoacteoside的含量。

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