柚皮素β-环糊精包合物的制备及对模型大鼠脉络膜新生血管形成的抑制作用Δ

徐新荣，于海涛，杭丽，邵雁，丁淑华，杨学文（.南京中医药大学附属医院眼科，南京009；.南京中医药大学药学院，南京 00；.南京中医药大学附属医院检验科，南京 009）

脉络膜新生血管（CNV）见于许多眼底疾病，如年龄相关性黄斑变性（AMD）、中心性渗出性脉络膜视网膜炎与高度近视引起的黄斑病变等，其中以AMD继发性CNV最常见，已成为老年人不可逆性视功能损害的主要原因之一。

对CNV的治疗药物研发近年取得了较大进展，主要是皮质类固醇抗炎药和血管内皮生长因子（VEGF）拮抗药。但是，皮质类固醇会导致眼压升高；VEGF拮抗药需要反复眼内注射，费用高，且长期生物安全性尚待进一步观察。因此，多途径寻找安全有效的防治CNV药物有重要的医学和社会意义。

柚皮素是广泛存在于植物中的二氢黄酮类化合物。有研究显示，柚皮素有抑制CNV形成的作用[1]，但其水溶性差，生物利用度不高。β-环糊精（β-CD）能改善药物的溶解度和稳定性，增强药物生物利用度。基于此，笔者制备了柚皮素β-CD包合物，考察其理化性质，并采用激光诱导的大鼠CNV模型，评价其对CNV形成的抑制作用，为其临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

752型紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限责任公司）；X′TRA型X射线衍射仪（瑞士ARL公司）；IR-100型红外分光光度计（美国Thermo Nicolet公司）；BS124 S型电子分析天平（德国Sartorius公司）；THZ-C型恒温振荡器（太仓市实验设备厂）；ZF-6050型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；OTHWS-2型恒温磁力搅拌器（上海志威电器有限公司）；BX51型荧光显微镜（日本Olympus公司）；Novus Varia型氪激光机（美国Lumenis公司）。

1.2 试剂

柚皮素（批号:67604-48-2，纯度:＞98%）、β-CD（批号:7585-39-9，纯度:98%）购自北京百灵威科技有限公司；荧光素异硫氰酸酯葡聚糖（FITC-D，美国Sigma-Aldrich公司，分子质量:2×106）；其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

BN大鼠15只，♂，体质量150～180 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[实验动物使用许可证号:SCXK（京）2006-009]。

2 方法

2.1 供试品的制备

2.1.1 柚皮素β-CD包合物的制备 按摩尔比1∶1准确称取柚皮素与β-CD，先将柚皮素用少量乙醇溶解，然后在搅拌条件下缓慢加入β-CD饱和水溶液均匀混合，于60Ⅸ下搅拌30min，停止加热并继续搅拌5 h，自然降温，4Ⅸ冷藏过夜，滤过，滤液经冷冻干燥机干燥24h，得柚皮素β-CD包合物。

2.1.2 柚皮素β-CD物理混合物的制备 按摩尔比1∶1准确称取柚皮素、β-CD，将称好的柚皮素和β-CD置于玻璃研钵中研磨均匀得柚皮素β-CD物理混合物。

2.2 柚皮素β-CD包合物物相表征的测定

2.2.1 红外光谱分析 称取供试品1.5mg和KBr 200mg，在红外灯下干燥，充分研磨后压片，扫描范围400～4000 cm－1。

2.2.2 X-射线衍射分析 测试条件:Cu靶；仪器温度:50Ⅸ；电压:40 kV；电流:100 mA；扫描速率:5°/min；扫描角度:3～50°。

2.3 柚皮素β-CD包合物含量与溶解度的测定

2.3.1 标准曲线的制备 称取柚皮素16.3mg，置100ml量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，分别量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml，置50ml量瓶中，乙醇定容至刻度，摇匀，贮藏，备用。测定在288nm波长处的吸光度（A）。以柚皮素质量浓度（c）为横坐标，A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为A＝0.0577 c+0.06274（r＝0.9994）。结果表明，槲皮素质量浓度在1.63～11.41mg/L范围内与A呈良好线性关系。

2.3.2 含量的测定 称取柚皮素β-CD包合物适量，置100ml量瓶中，用70%乙醇超声溶解并稀释至刻度。吸取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，70%乙醇定容至刻度，于288nm波长处测定A，代入回归方程，计算c，求算柚皮素β-CD包合物中柚皮素的含量。

2.3.3 溶解度的测定 称取柚皮素β-CD包合物适量，于水溶液中使成过饱和溶液，于37Ⅸ、100次/min恒温空气浴振荡48 h，吸取上清液，用0.8 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，适当稀释后于288nm波长处测定A，代入回归方程，求算柚皮素β-CD包合物中柚皮素的溶解度。柚皮素溶解度测定同上。

2.4 柚皮素β-CD包合物对模型大鼠的保护作用

2.4.1 模型的复制 参考文献[2]方法。im氯胺酮（50mg/kg）麻醉大鼠，用0.5%托吡卡胺和新福林混合散瞳剂散瞳，采用氪黄激光（波长568nm，参数:光斑直径为100μm，曝光时间为0.1s，功率为150～200mW），在120D专用前置镜下距视盘2～4盘径，围绕视盘在视网膜大血管间光凝8个点，看到Bruch膜被击破后产生小气泡为合格光凝点，有视网膜、脉络膜或玻璃体出血者剔除。

2.4.2 分组与给药 15只大鼠均分为3组，即溶媒对照（等容溶媒）组、柚皮素（20mg/kg）组与柚皮素β-CD包合物（97.4mg/kg）组。视网膜光凝后开始ip给药，每天1次，连续4周。

2.4.3 脉络膜铺片法测量CNV面积 末次给药后iv FITC-D，1 h后摘取眼球于40 g/L多聚甲醛溶液中固定1 h，显微镜下沿赤道部打开眼球，去除前节，揭除视网膜神经层，获得视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜复合体标本，以视神经为中心，放射状剪开标本，将视网膜色素上皮细胞（RPE）面向下置于盖玻片上，封片、烤片，标本置于荧光显微镜下观察，拍片，用Image J图像分析软件进行分析。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 红外光谱分析结果

显示柚皮素在1790～1540、1530～1200、960～750 cm－1有很强的吸收信号，柚皮素和β-CD包合后，受β-CD影响明显产生了红移。柚皮素β-CD物理混合物光谱可以明显看出仅是柚皮素和β-CD二者的叠加。红外光谱见图1。

图1 红外光谱图A.β-CD；B.柚皮素；C.柚皮素β-CD物理混合物；D.柚皮素β-CD包合物Fig 1 FTIR spectrogramsA.β-CD；B.naringenin；C.ncringenin-β-CD physical mixture；D.naringenin-β-CD

3.2 X-射线衍射分析结果

可见，柚皮素在 10.7、11.4、15.6、17.3、15.2、20.6、22.3、23.7、25.7、27.8°有一系列强烈衍射峰，这表明了它的晶体性质，而β-CD则表现为几个很宽的峰，说明β-CD的无定形性质。柚皮素β-CD物理混合物的衍射图则为柚皮素和β-CD衍射峰的叠加，没有出现新的峰，但峰的强度有所变化。柚皮素β-CD包合物只有2个很宽的β-CD衍射峰，柚皮素的特征峰消失，说明柚皮素被β-CD包合。X-射线衍射图见图2。

图2 X-射线衍射图A.柚皮素；B.β-CD；C.柚皮素β-CD物理混合物；D.柚皮素β-CD包合物Fig 2 X-ray diffraction spectraA.naringenin；B.β-CD；C.naringenin-β-CD physical mixture；D.naringenin-β-CD

3.3 溶解度与含量测定结果

柚皮素β-CD包合物中柚皮素包合率为81.06%，质量分数为20.53%；柚皮素在水中的溶解度为71.85μg/ml，包合后柚皮素的溶解度为846.28μg/ml，可见β-CD能显著提高柚皮素在水中的溶解度。

3.4 柚皮素β-CD包合物对模型大鼠CNV面积的影响

与溶媒对照[（34.73±1.53）×103μm2]组比较，柚皮素[（20.91±1.47）×103μm2]组与柚皮素β-CD包合物[（13.20±1.38）×103μm2]组大鼠CNV面积减少，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；与柚皮素组比较，柚皮素β-CD包合物组大鼠CNV面积减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。大鼠脉络膜铺片见图3。

图3 大鼠脉络膜铺片A.溶媒对照组；B.柚皮素组；C.柚皮素β-CD包合物组Fig 3 Representative fluorescent photos of choroidal in ratsA.solvent control group；B.naringenin group；C.naringenin-β-CD

4 讨论

近年来，中药抑制眼部新生血管形成为眼科药物研究的热点。许多黄酮类药物有较强CNV形成抑制作用，如柚皮素、芹黄素、汉防己甲素[3-4]等。

柚皮素广泛存在于柠檬、葡萄汁、橘子、枳壳、胡柚皮中，具有广泛的生物活性，如抗动脉粥样硬化、抗炎、抗氧化、抗癌、祛痰、降脂等。笔者前期研究显示，柚皮素能改善脉络膜血流，抑制环氧合酶（COX）-2、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，从而下调VEGF表达，抑制CNV形成[5]。但是，柚皮素的水溶性差，生物利用度低，尚不能用于临床。CD分子有一个含有富电性疏水空腔和亲水性外壁的特殊结构[6-8]，针对许多药物分子的水溶性和稳定性缺陷，CD常用作改善药物分子缺点的载体。戴玉杰等[9]用羟丙基（HP）-β-CD对对乙酰氨基苯乙酸进行包合，发现HP-β-CD能够明显增大对乙酰氨基苯乙酸的溶解度；张艳斌等[10]制备P-糖蛋白底物盐酸小檗碱HP-β-CD包合物，采用单向肠灌流法考察CD包合作用对盐酸小檗碱在大鼠体内肠吸收的影响，结果发现盐酸小檗碱被HP-β-CD包合后，在小肠中的吸收速率常数及有效渗透系数明显增大，分别为原来的5.31、5.05倍。Shulman M等[11]研究结果显示，柚皮素用HP-β-CD包合后，溶解度为原来的400倍，跨Caco-2细胞转运能力为原来的11倍，在大鼠体内生物利用度检测结果中AUC为原来的7.4倍，cmax为原来的14.6倍。目前，CD包合物的研究主要集中在制备工艺、理化性质和生物利用度方面，用于疾病研究的较少。笔者制备的柚皮素β-CD包合物，采用红外光谱和X-射线衍射法对包合物进行鉴定，证明柚皮素和β-CD形成了稳定的包合物；溶解度检测结果显示β-CD包合后柚皮素在水中的溶解度为原来的11.8倍，这与文献[1]报道比偏低，可能与采用的包合物为β-CD，其水溶性较HP-β-CD低有关。同时，通过大鼠激光诱发CNV模型体内研究证实，柚皮素β-CD包合物抑制CNV形成的作用强于柚皮素，提示柚皮素β-CD包合后生物活性得到明显提高。

目前，已经进入各国药典的CD及其衍生物有α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD、二甲基（DM）β-CD、三氧甲基（TM）β-CD和磺基丁基醚（SEB）β-CD等7种，CD包合的药物已经上市的有30多种，剂型包括片剂、注射剂、胶囊剂、栓剂和滴眼剂等。下一步笔者将采用CD衍生物进行柚皮素包合，筛选出生物利用度更高的包合物进行临床前期研究，为开发出有临床应用价值的CNV防治药物打下基础。

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