天麻素预处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的可能机制

位 凯，王 飞，张 瑾，李 珍，沈 兵，王烈成，孔德虎，胡金兰

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)其病理机制主要与氧自由基过多、钙超载、炎症反应、细胞凋亡等有关［1］。天麻是一种具有多种功效的中药，天麻素(4-羟甲基苯甲醇-β-D吡喃葡萄糖甙)是其活性最高的有效单体，具有改善神经系统血供、镇静、催眠和抗惊厥的作用［2］，还具有降低外周血管阻力和血压的作用［3－4］。该课题组前期研究［5］显示天麻素预处理能明显减轻大鼠MIRI，可能与减轻MIRI时的炎症细胞浸润有关，在炎症反应中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)起主要作用，因此该实验在原有实验的基础上，从炎症因子变化的角度进一步探讨天麻素预处理减轻大鼠MIRI作用的可能机制。前期研究［5］还表明天麻素可能会抑制Ca2+超载，这种作用是否与肌浆网Ca2+－ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+－ATPase，SERCA)有关，也是本研究要解决的问题。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 60只健康成年SPF级SD大鼠(安徽省实验动物中心)，雌雄不拘，体重(230±10)g，随机分为假手术组，MIRI组，0.1、0.2 和0.4 g/kg天麻素组。

1.2 主要试剂及仪器 天麻素(批号:2010081，纯度:99.2%，江苏宝泽堂医药科技有限公司);TNF-α、IL-6、SERCA检测试剂盒(上海森雄科技实业有限公司);其他试剂均为分析纯;BL-420E生物信号采集分析系统、动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司);SpectraMax190酶标仪(Molecular Devices公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠MIRI模型制备 于每日上午9∶00对各组大鼠灌胃给药:假手术组与MIRI组均给予生理盐水灌胃，天麻素组分别给予0.1、0.2和0.4 g/kg的天麻素灌胃，连续7 d。于第7天灌胃后建立大鼠MIRI模型:用10%水合氯醛以3 ml/kg的剂量腹腔注射麻醉，做气管插管，连接呼吸机(呼吸频率60次/min，潮气量11 ml/次，呼 －吸之比为1∶2)。四肢皮下连接电极，标Ⅱ导联接BL-420E生物信号采集分析系统连续记录心电图。在左侧第3～4肋间隙之间钝性分离肌肉，暴露心脏，在左心耳下缘处以冠状静脉主干为标志，用5-0号带针无创缝合线进针，向肺动脉圆锥方向出针，连同直径2 mm塑料管一起打活结结扎左冠状动脉前降支，缺血成功的标志为Ⅱ导联R波增宽，ST段抬高，缺血30 min后，松开结扎线，再灌注2 h，再灌注成功的标志为抬高的ST段下降，S波幅值恢复50%以上。假手术组术中只穿线，不结扎左冠状动脉前降支。

1.3.2 血清及心肌组织检测 各组于缺血再灌注2 h后分别从腹主动脉取血约4 ml，以3 500 r/min离心10 min，得到大鼠血清，分装，－20℃冰箱储存;并取各组结扎线下方左心室前壁心肌组织，切取一部分心肌组织于－80℃冰箱储存，剩余部分置于4%福尔马林溶液中固定，将用于形态学实验。按试剂盒说明书检测血清及心肌组织中TNF-α、IL-6和SERCA水平，用酶标仪测各组吸光度值。

1.3.3 心肌组织形态学检测 取左心室前壁心肌组织进行HE染色，光学显微镜下观察各组大鼠心肌组织形态学的变化。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件分析，数据以±s表示，采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 天麻素预处理对血清及心肌组织中TNF-α的影响 与假手术组相比，MIRI组血清及心肌组织中TNF-α含量均明显增高，差异有统计学意义 (P＜0.01)，说明MIRI时 TNF-α参与其中。与MIRI组相比，0.1 g/kg天麻素组血清及心肌组织的TNF-α含量略减少，差异无统计学意义(P＞0.05)，而0.2、0.4 g/kg天麻素组血清及心肌组织的TNF-α含量均减少，差异有统计学意义(P＜0.01)，说明天麻素预处理可以减轻心肌缺血再灌注时TNF-α的释放;不同浓度天麻素组两两比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明其作用无剂量依赖性，见表1。

表1 各组大鼠血清及心肌组织中TNF-α含量比较(n=12，±s)

表1 各组大鼠血清及心肌组织中TNF-α含量比较(n=12，±s)

与假手术组比较:＊＊P ＜0.01;与 MIRI组比较:##P ＜0.01

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2.2 天麻素预处理对血清及心肌组织中IL-6的影响 与假手术组相比较，MIRI组血清及心肌组织中的IL-6含量均明显增高，差异有统计学意义 (P＜0.01)，说明MIRI时IL-6参与其中。与MIRI组相比，0.1 g/kg天麻素组血清及心肌组织的IL-6含量略减少，差异无统计学意义(P＞0.05)，而0.2、0.4 g/kg天麻素组血清的IL-6含量减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，心肌组织中的IL-6含量亦减少，差异有统计学意义(P＜0.01)，说明天麻素预处理可以减轻心肌缺血再灌注时IL-6的释放;不同浓度天麻素组两两比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明其作用无剂量依赖性，见表2。

表2 各组大鼠血清及心肌组织中IL-6含量比较(n=12，±s)

表2 各组大鼠血清及心肌组织中IL-6含量比较(n=12，±s)

与假手术组比较:＊＊P＜0.01;与MIRI组比较:#P＜0.05，##P＜0.01

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2.3 天麻素预处理对心肌组织中SERCA的影响

与假手术组相比较，MIRI组心肌组织中的SERCA含量明显减少，差异有统计学意义(P＜0.01)，说明MIRI时心肌组织中SERCA含量减少。与MIRI组相比，0.1 g/kg天麻素组心肌组织中的SERCA含量略增高，差异无统计学意义(P＞0.05)，而0.2、0.4 g/kg天麻素组心肌组织中的SERCA含量明显增高，差异有统计学意义(P＜0.01)，说明天麻素预处理可以增加心肌缺血再灌注时SERCA的含量;不同浓度天麻素组两两比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明其作用无剂量依赖性，见表3。

表3 各组大鼠心肌组织中SERCA含量比较(n=12，±s)

表3 各组大鼠心肌组织中SERCA含量比较(n=12，±s)

与假手术组比较:＊＊P＜0.01;与MIRI组比较:##P＜0.01

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2.4 天麻素预处理对心肌组织形态学的影响 各组心肌组织经HE染色后可见:假手术组心肌细胞排列整齐，胞膜完整，界限清晰，胞质、胞核着色均匀，见图1A;MIRI组心肌细胞排列不整齐，界限不清，有明显水肿，毛细血管扩张，可见红细胞、炎症细胞浸润，见图1B，这从形态学上进一步证明模型制备成功;0.1 g/kg天麻素组排列不整齐，界限不清，水肿较明显，毛细血管扩张，可见红细胞、炎症细胞浸润，见图1C;而0.2、0.4 g/kg天麻素组心肌细胞排列较整齐，横纹较清晰，界限较清楚，无明显水肿，仅有少量红细胞、炎症细胞浸润，见图1D、E。从形态学上进一步证明天麻素预处理后可以减轻MIRI时的炎细胞浸润。

3 讨论

MIRI是心肌在缺血的基础上恢复血流后，组织器官的损伤反而加重的现象，是一个复杂的病理生理过程，其中炎症反应贯穿于心肌细胞损伤的全过程［6］。本课题组前期研究［5］显示天麻素预处理后能减轻MIRI时心肌组织间隙炎症细胞的浸润，说明天麻素能抑制炎细胞浸润，在炎症反应中TNF-α和IL-6起到主要作用，那么天麻素是否通过影响TNF-α和IL-6来实现抑制炎细胞浸润?因此，本实验通过观察大鼠血清及心肌组织中炎性因子TNF-α、IL-6的含量变化来进一步研究天麻素预处理对MIRI的作用。

TNF-α是一种重要的细胞炎症因子，心肌是其作用的靶器官［7］，通过多种机制参与MIRI过程，不仅可以激活细胞因子级联反应，而且还可以促进氧自由基的产生、活化中性粒细胞、诱导心肌细胞凋亡，加重心肌损伤［8］。IL-6被称为白介素家族的核心成员，具有广泛的生物学效应［9］，参与炎症反应的调节，可以诱导中性粒细胞内流入缺血的心肌组织，刺激中性粒细胞、心肌细胞表面分别表达CD11b/CD18及细胞间黏附分子-1，介导与心肌细胞结合，损伤心肌［10］。这两种细胞因子的水平与缺血再灌注后的损伤程度有密切关联。本研究显示MIRI组的血清及心肌组织中炎症因子TNF-α和IL-6含量明显高于假手术组，这说明 TNF-α和IL-6均参与了缺血再灌注损伤时的炎症反应，而0.2、0.4 g/kg天麻素组与MIRI组相比，TNF-α和IL-6含量显著降低，说明天麻素预处理能减轻缺血再灌注损伤时炎症因子TNF-α和IL-6的释放。同时形态学表明，缺血再灌注时炎症细胞浸润明显，而0.2、0.4 g/kg天麻素预处理后炎细胞浸润明显减轻，亦从形态学角度再次证明了上述观点。以上结果提示天麻素预处理后能通过减少缺血再灌注时炎症因子TNF-α和IL-6的释放，从而抑制炎症因子引起的中性粒细胞迁移浸润，减轻炎症损伤的恶性循环，对心肌细胞起到保护作用。

Ca2+作为第二信使在心肌兴奋收缩耦联中起关键作用。肌浆网中的SERCA负责调控肌浆网对Ca2+的摄取，将心肌细胞胞浆中的Ca2+摄回肌浆网中。缺血再灌注后，由于细胞内环境的改变，导致细胞内酸中毒，从而抑制SERCA的活性，降低肌浆网摄钙的能力，久之细胞内就会发生钙超载，加重心肌损伤［11］。本研究显示0.2、0.4 g/kg天麻素预处理后心肌组织中的SERCA含量增加，提示天麻素能够增加缺血再灌注损伤时心肌组织中的SERCA的含量，从而增加对肌浆网Ca2+的摄取，减轻细胞内钙超载，对心肌细胞起到一定的保护作用。因此天麻素抑制Ca2+超载可能与其增加SERCA含量有关。

综上所述，本实验进一步证明天麻素预处理能够减轻MIRI，其机制可能与减少炎症因子TNF-α和IL-6的释放，增加SERCA的含量有关。

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