阿法替尼和吉非替尼分别联合培美曲塞对人肺腺癌细胞作用的研究

边 劲，王 琳，寻 琛，黄 伟

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)的临床应用使晚期非小细胞肺癌的治疗获得了突破性进展。吉非替尼、厄罗替尼在临床上已经广泛应用，并且取得了很好的疗效，但是长期治疗几乎所有患者均会产生耐药。研究［1－2］显示二代双重不可逆性酪氨酸激酶抑制剂阿法替尼(afatinib，BIBW2992)能够克服肺癌治疗中的获得性耐药。同时，目前关于EGFR-TKIs和化疗药物的联合应用一直是研究的热点。该实验旨在探讨BIBW2992、吉非替尼分别与培美曲塞联合对吉非替尼敏感和耐药型肺腺癌细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用，为临床寻找克服第1代EGFR-TKIs耐药制定方案提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人肺腺癌H1975细胞(EGFR基因外显子20点突变，耐药型)、PC-9细胞(EGFR基因外显子19缺失，敏感型)由中国人民解放军第八一医院肿瘤中心实验科提供;胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI-1640培养基、DMEM培养基均购自美国Thermo公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Amresco公司;二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司;吉非替尼和BIBW2992分别购自英国阿斯利康和德国勃林格殷格翰公司;培美曲塞购自美国礼来公司;内参(β-actin)、抗细胞胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)单克隆抗体一抗购自美国Zymed公司;鼠源二抗购自美国Cell Signaling公司;ECL化学发光试剂盒购自美国GE Healthcare公司;BCA试剂盒购自美国Pierce公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司。

1.2 细胞培养 PC-9、H1975细胞分别用含10%小牛血清的DMEM、RPMI-1640高糖培养液置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中常规培养。每1～3 d传代1次。

1.3 MTT法检测药物对PC-9、H1975细胞生长作用影响 取生长良好的PC-9、H1975细胞制成1×108个/L细胞悬液，分别接种于96孔板中，每孔接种100 μl，每组设置6个复孔。细胞培养24 h贴壁生长后，再按实验设计分别加入100 μl含有不同浓度 (0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L)BIBW2992、吉非替尼、培美曲塞的培养基作用72 h，每孔加入MTT 20 μl，温箱内孵育4 h弃上清液，加入100 μl盐酸异丙醇，振荡仪处理10 min后，用酶联免疫检测仪测定570 nm波长下各孔吸光值(A)，计算出各单药作用72 h的半数抑制浓度(IC50)。以BIBW2992、吉非替尼、培美曲塞分别在2种细胞中的IC50作为固定浓度单药及联合作用于PC-9、H1975细胞。实验分组:① PBS对照组(C);② 吉非替尼单独作用72 h组(G);③ BIBW2992单独作用72 h组(B);④ 培美曲塞单独作用72 h组(P);⑤吉非替尼联合培美曲塞作用72 h组(G+P);⑥BIBW2992联合培美曲塞作用72 h组(B+P)，实验重复3次。细胞增殖抑制率(%)=1－(实验组A值－空白组A值)/(对照组A值－空白组A值)×100%。

1.4 流式细胞仪检测各组细胞周期分布及凋亡

取对数生长期细胞调整至1×108个/L，每孔2 ml，接种于6孔板，培养24 h后，以BIBW2992、吉非替尼、培美曲塞分别在2种细胞中的IC50作为固定浓度单药及联合作用于PC-9、H1975细胞72 h后，收集细胞，在－20℃保存过夜。将固定的细胞离心弃上清液，PBS洗细胞2次，再次离心弃上清液加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞，根据说明书加入Annexin V-FITC和PI染液，混匀、室温、避光，反应10～15 min，用流式细胞仪测定PI荧光强度(激发波长480 nm，吸收波长630 nm)，检测细胞周期分布，并计算凋亡百分比。

1.5 Western blot法检测 BIBW2992、吉非替尼对细胞TS表达的影响 取对数生长期细胞调整至1×108个/L，每孔2 ml，接种于6孔板，培养24 h后，按实验设计分组给药后收集细胞，细胞裂解液裂解细胞，收集细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，等量上样，将蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜上，室温下5%牛血清白蛋白封闭2 h，加入一抗(1∶800)摇床孵育过夜，TBST漂洗3次，每次约10 min，二抗(1∶2 000)37℃摇床孵育2 h，TBST漂洗3次，每次约10 min，电化学发光显色系统显色，曝光，显影，凝胶分析系统分析蛋白的表达情况。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件分析，数据以±s表示，各组之间比较采用单因素方差分析，两组之间互相比较采用配对t检验。

2 结果

2.1 BIBW2992、吉非替尼单药及分别与培美曲塞联合对细胞增殖抑制作用 BIBW2992、吉非替尼单药或分别联合培美曲塞均能抑制PC-9、H1975细胞生长。BIBW2992和吉非替尼单药作用72 h抑制PC-9细胞生长的IC50分别为5.81×10－10mol/L和4.54×10－8mol/L，BIBW2992和吉非替尼单药作用72 h抑制H1975细胞生长的IC50分别为3.36×10－7mol/L 和1.18 ×10－5mol/L。分别取 BIBW2992、吉非替尼和培美曲塞在2种细胞中的IC50作为固定浓度研究两药联合对PC-9和H1975细胞的生长抑制作用。结果显示，在PC-9细胞中(B+P)、(G+P)组较之单药组生长抑制作用均明显增强，差异有统计学意义(P＜0.05)。在H1975细胞中仅(B+P)组对细胞生长抑制有协同增效作用，较单药组明显提高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

图1 BIBW2992和吉非替尼单药及分别与培美曲塞联合对PC-9、H1975细胞周期的影响

2.2 BIBW2992吉非替尼单药及分别与培美曲塞联合对细胞凋亡及周期的影响 培美曲塞单药作用于2种细胞时主要将细胞阻滞在 S期，分别为56.55%、55.98%。BIBW2992、吉非替尼单药作用于2种细胞时大部分细胞主要被阻滞在G0/G1期，在PC-9细胞中分别为68.33%、64.12%，在 H1975细胞中分别为60.82%、63.77%。(B+P)、(G+P)组细胞杂乱的分布于各个周期见图1。(B+P)、(G+P)组在PC-9细胞中较之单药组均明显提高了凋亡作用，差异有统计学意义(P＜0.05)。而在H1975细胞中，仅(B+P)组较单药组诱导凋亡作用明显提高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1、图2。

2.3 BIBW2992、吉非替尼对 PC-9、H1975 细胞 TS表达的影响 在PC-9细胞中BIBW2992和吉非替尼均可以显著降低TS，而在H1975细胞中随着药物浓度逐渐增加BIBW2992仍显著降低TS，而吉非替尼对TS表达无显著抑制作用，见图3。

表1 BIBW2992和吉非替尼分别与培美曲塞联合对PC-9、H1975细胞生长抑制及凋亡作用(%，n=6，±s)

表1 BIBW2992和吉非替尼分别与培美曲塞联合对PC-9、H1975细胞生长抑制及凋亡作用(%，n=6，±s)

与G+P组比较:＊＊P＜0.01;与 B+P组比较:##P ＜0.01

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3 讨论

EGFR-TKIs是较早应用于临床抗肿瘤的靶向药物之一。绝大部分EGFR突变的非小细胞肺癌患者都对可逆性的第1代EGFR-TKIs敏感。但随着治疗时间的延长最终都会产生获得性耐药，如EGFR790位点上的苏氨酸(threonjne)被甲硫氨酸(methlonlne)取代(T790M突变)造成近50%的肿瘤患者产生获得性耐药［3］，然而新的不可逆性双重酪氨酸激酶抑制剂BIBW2992给患者带来新的希望。BIBW2992不可逆的与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)和人表皮受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)酪氨酸激酶结合抑制其活性，进而阻断EGFR-HER2介导的肿瘤细胞信号传导途径，从而抑制肿瘤细胞的增殖与转移，诱导肿瘤细胞的凋亡。文献［1－2］报道阿法替尼对既往接受过化疗及EGFR-TKIs治疗失败的晚期非小细胞肺癌患者在治疗上具有重要意义。文献［4－5］报道在EGFR突变患者中一线应用BIBW2992与吉非替尼的效果相当，并且较之化疗明显延长了患者的无疾病进展生存期。

图2 BIBW2992和吉非替尼分别与培美曲塞联合对H1975细胞凋亡的影响

图3 BIBW2992、吉非替尼对PC-9、H1975细胞TS表达的影响A:PC-9细胞;B:H1975细胞

研究［6］显示BIBW2992虽然可以克服 T790M获得性耐药，但是敏感性较之突变敏感型细胞降低。该实验中BIBW2992在 H1975细胞中的 IC50约为PC-9细胞的600倍，但仍然是临床治疗中可以达到的血药浓度［7］，而吉非替尼在耐药细胞 H1975中IC50约为PC-9细胞的300倍，在临床治疗中无法获得。T790M突变不仅影响BIBW2992对肺腺癌细胞的生长抑制作用，同样降低其他不可逆性EGFRTKIs(如CL-387、785和PF00299804)对肺腺癌细胞的敏感性［8－9］。因而新型靶向药物在临床应用对于获得性耐药患者尽管有效，但是疗效可能会受到一定的限制。目前关于EGFR-TKIs联合化疗已经逐渐成为研究的热点。研究［10］显示的一项多中心开放Ⅱ期临床研究表明培美曲塞同步联合厄洛替尼能提高晚期肺癌患者的中位无疾病进展时间和中位总生存时间。Yoshimura et al［11］研究中也发现 EGFRTKIs治疗耐药后运用培美曲塞序贯联合吉非替尼方案患者仍可以明显获益。这提示可以将EGFRTKIs与培美曲塞联合以期达到协同增效作用从而更好的克服EGFR-TKIs耐药。因而本实验同时将吉非替尼、BIBW2992分别与培美曲塞联合作用于PC-9、H1975细胞，探讨二者是否存在协同增效作用。

实验结果提示BIBW2992与培美曲塞联合对PC-9、H1975细胞的增殖抑制和诱导凋亡均存在协同增效作用，而吉非替尼与培美曲塞联合仅在PC-9细胞中起到协同增效作用，这与Takezawa et al［6］研究结果基本一致。通过观察细胞周期结果发现，培美曲塞主要将细胞阻滞在S期，而BIBW2992和吉非替尼均将细胞主要阻滞在G0/G1期，二者联合将细胞杂乱阻滞在各周期，从细胞周期角度无法解释两药联合增效的机制。

研究［12］显示吉非替尼和另一种针对TS靶点的药物S-1联合无论在野生型还是突变型细胞中均可以起到协同抗肿瘤作用，主要由于吉非替尼降低TS从而增强S-1对肺腺癌细胞的抑制作用有关。而在T790M突变的肺腺癌细胞中，吉非替尼无法显著降低TS，因而无法起到协同增效作用［13］。但有研究［6］显示在吉非替尼耐药的肺腺癌细胞系中，BIBW2992仍可以明显降低EGFR磷酸化以及下调TS蛋白水平。本实验将不同浓度的BIBW2992和吉非替尼分别作用于 PC-9、H1975细胞后发现，BIBW2992和吉非替尼均可以显著下调PC-9细胞TS，而在H1975细胞中，BIBW2992仍然可以显著降低TS，而吉非替尼下调TS作用不明显。这可能是BIBW2992与培美曲塞联合在吉非替尼耐药细胞中仍然可以起到协同增效作用的主要机制。

本实验显示BIBW2992不仅可以克服吉非替尼耐药，且与针对TS靶点的药物培美曲塞联用时可以对耐药细胞H1975具有协同增效作用。但是本实验仅仅选择了一种T790M突变耐药细胞，一种突变敏感型细胞，因而还有待于在更多不同类型肺腺癌细胞以及与其他TS靶点药物(如S-1、5-FU)联合加以证实，同时有待于在体内进行实验以期更好的指导临床方案的选择。目前，已经有研究［14］表明除了T790M突变产生的获得性耐药，HER2基因扩增在EGFR-TKIs以及西妥昔单抗的获得性耐药中同样存在重要作用，而由于BIBW2992的双靶点作用，BIBW2992将在未来克服针对EGFR靶向药物的获得性耐药治疗中具有更加重大的意义。

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