地塞米松及N-乙酰半胱氨酸抑制A549细胞IL-8及ICAM-1表达的机制研究

项 琪，付 欣，冉丕鑫，张 锦，郑西卫，陈 娟，郭园园

（1.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004；2.广州医科大学，广东 广州 510182；3.宁夏医科大学总医院呼吸与危重症医学科，宁夏银川 750004；4.大庆市第四医院，黑龙江 大庆 163712）

慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是一种可以预防和治疗的常见疾病，其特征是持续存在的气流受限。气流受限常呈进行性发展，伴有气道和肺对有害颗粒或气体所致慢性炎症反应的增加［1］。慢性炎症是慢阻肺发病的根本机制。糖皮质激素是临床常用的治疗多种炎症性疾病的抗炎药物，对于哮喘等呼吸系统疾病，糖皮质激素发挥重要抗炎作用，然而诸多的副作用限制了其在临床中的应用，而且研究发现慢阻肺存在一定程度的激素抵抗。因此，研发新的抗炎药物是慢阻肺防治中的重要内容。我们前期的研究表明：抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸（NAC）具有良好的抗炎作用，可以抑制炎症因子表达，但具体机制不明。糖皮质激素抗炎作用的发挥主要是通过乙酰化信号机制，作用于组蛋白去乙酰化酶（HDAC），通过影响炎症相关基因的转录来发挥抗炎作用［2-3］，本课题通过对比研究 DXM与NAC对人肺泡上皮细胞A549细胞炎症因子IL-8及ICAM-1炎症基因的表达及炎症相关转录因子的表达的影响，探讨DXM及NAC抗炎作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌细胞A549（美国菌种保存中心，批号：CCL-185），人IL-8试剂盒购自北京达科为公司。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）购自美国Bisource公司，脂多糖（lipopolysaccharide）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）和地塞米松21-磷酸二钠（DXM）购自美国Sigma公司，胞质、胞核蛋白提取试剂盒购自北京赛诺博公司，BCA法蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司，HDAC活性检测试剂盒购自北京达科为公司，激素受体（GR）抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，组蛋白去乙酰化酶1，2（HDAC1，2）抗体购自美国 Sant Cruz公司，转录因子核因子-κB（NF-κB）磷酸化抗体及活化蛋白-1（AP-1）抗体购自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A549细胞用含100 ml·L-1胎牛血清（FBS）的DMEM（购自Gibco公司）培养基，在37℃、50 m l·L-1CO2细胞培养箱培养，3 d换液1次。

1.2.2 实验分组 未处理组、TNF-α干预组、LPS干预组、DXM干预组、NAC干预组、TSA干预组、TNF-α和DXM共同干预组、TNF-α和NAC共同干预组、LPS和DXM共同干预组、LPS和NAC共同干预组。

1.2.3 各项指标检测

1.2.3.1 ELISA法检测 IL-8，流式细胞术检测ICAM-1 根据实验分组分别加入终浓度为10μg·L-1的TNF-α作用4 h；或分别加入终浓度为10-6mol·L-1的 DXM和30 mmol·L-1的 NAC预孵育30 min，再加入终浓度为10μg·L-1的TNF-α作用4 h。

1.2.3.2 蛋白印迹法检测GR的表达 根据实验分组分别加入终浓度为10μg·L-1的TNF-α、10mg·L-1的LPS作用4 h；或分别加入终浓度为10-6mol·L-1的 DXM和30 mmol·L-1的 NAC预孵育30 min，再加入终浓度为 10μg·L-1的 TNF-α、10 mg·L-1的LPS作用4 h。

1.2.3.3 蛋白印迹法检测HDAC1、HDAC2的表达根据实验分组，分别加入终浓度为10-5、10-6、10-7、10-8mol·L-1的 DXM、10μg·L-1的 TSA；或者根据实验分组，分别加入终浓度为10μg·L-1的TNF-α、10 mg·L-1的 LPS作用 4 h；或分别加入终浓度为 10-6mol·L-1DXM和 30 mmol·L-1的NAC预孵育30 min后再加入终浓度为10μg·L-1的 TNF-α、10 mg·L-1的 LPS作用 4 h。

1.2.3.4 蛋白印迹法检测C-jun及NF-κB的表达根据实验分组，分别加入终浓度为10μg·L-1的TNF-α、10 mg·L-1的 LPS作用 4 h；或分别加入终浓度为 10-6mol·L-1DXM和 30 mmol·L-1的NAC预孵育30 min后再加入终浓度为10μg·L-1的 TNF-α、10 mg·L-1的 LPS作用 4 h。

1.2.3.5 分光光度法检测HDAC活性 根据实验分组，分别加入终浓度为10μg·L-1的 TNF-α、10 μg·L-1的TSA作用24 h；或分别加入终浓度为10-6mol·L-1DXM和30 mmol·L-1的 NAC预孵育30 min后再加入终浓度为10μg·L-1的TNF-α、10 mg·L-1的 LPS作用24 h。

1.3 统计学分析 采用SPSS11.0软件对数据进行分析，数据用¯x±s表示，多个样本均数之间的两两比较采用LSD-t检验进行分析。

2 结果

2.1 DXM、NAC对A549细胞IL-8、ICAM-1表达的影响 在10μg·L-1的TNF-α作用前、后，A549细胞IL-8蛋白浓度分别为（1.67±0.07）ng·L-1和（3 576.04±3.02）ng·L-1，两组相比差异有统计学意义（t＝-1931.83，P＜0.05）。与 TNF-α单独作用相比，DXM、NAC预作用细胞可明显降低TNF-α诱导下IL-8的高表达，差异有统计学意义（tDXM＝1893.46，P＜0.05；tNAC＝1894.8，P＜0.05）（Tab 1）。在 10μg·L-1的 TNF-α作用前后细胞ICAM-1蛋白浓度（荧光强度）分别为0.59±0.09和29.72±3.32，两组相比差异有统计学意义（t＝15.17，P＜0.05）。与 TNF-α单独作用相比，DXM、NAC预作用细胞可明显降低TNF-α诱导的ICAM-1的表达，差异有统计学意义（tDXM＝4.27，P＜0.05；tNAC＝6.14，P＜0.05），见 Tab 2。

Tab 1 Effect of A549 cells on IL-8 expression induced by TNF-α and abolished by NAC and DXM in A549 cells（±s，ng·L-1）

Tab 1 Effect of A549 cells on IL-8 expression induced by TNF-α and abolished by NAC and DXM in A549 cells（±s，ng·L-1）

**P＜0.01 vs control；＃＃P＜0.01 vs TNF-αtreatment

Group IL-8t P Control 1.67±0.07 TNF-α 3576.04±3.20** -1931.83 ＜0.05 DXM 1.20±0.06** 8.261 ＞0.05 NAC 1.23±0.06** 7.91 ＞0.05 DXM＋TNF-α 19.44±0.50＃＃ 1893.46 ＜0.05 NAC＋TNF-α 26.41±0.51＃＃1894.8＜0.05

Tab 2 Effect of A549 cells on ICAM-1 expression induced by TNF-αand abolished by NAC and DXM in A549 cells（±s）（fluorescence intensity）

Tab 2 Effect of A549 cells on ICAM-1 expression induced by TNF-αand abolished by NAC and DXM in A549 cells（±s）（fluorescence intensity）

**P＜0.01 vs control；＃＃P＜0.01 vs TNF-αtreatment

Group ICAM-1t P Control 0.59±0.09 TNF-α 29.72±3.32** 15.17 ＜0.05 DXM 0.11±0.01** 0.10 ＞0.05 NAC 0.49±0.08** 1.00 ＞0.05 DXM＋TNF-α 18.58±3.07＃＃ 4.27 ＜0.05 NAC＋TNF-α 15.18±2.42＃＃6.14 ＜0.05

2.2 DXM、NAC对A549细胞GR表达的影响在TNF-α、LPS作用后，胞质内GR表达增强，加入DXM干预后激素受体胞质的表达降低而胞核的表达却增强；NAC作用后，GR的胞质和胞核的表达没有变化。见Fig 1、2。

Fig 1 Western blot test effect of A549 cells on GR expression induced by TNF-α，LPS and abolished by DXM in A549 cellsL：LPS；T：TNF-α；D：DXM

2.3 不同浓度 DXM对 A549细胞 HDAC1、HDAC2蛋白表达的影响 随着DXM浓度的增大（10-5、10-6、10-7、10-8mol·L-1的 DXM），HDAC1、HDAC2表达均有不同程度的增强，以10-6mol·L-1的DXM刺激后HDAC1、HDAC2表达最强，TSA能明显降低HDAC的表达，见Fig 3。

Fig 2 W estern blot test effect of A549 cells on GR expressioninduced by TNF-α，LPS and abolished by NAC in A549 cells L：LPS；T：TNF-α；N：NAC

Fig 3 W estern blot test effect of A549 cells on HDAC1，HDAC2 expression abolished by different concentrations of DXM in A549 cells10-5：10-5 mol·L-1 concentration of DXM；10-6：10-6mol·L-1 concentration of DXM；10-7：10-7 mol· L-1 concentration of DXM；10-8：10-8mol·L-1 concentration of DXM

2.4 DXM、NAC对 A549细胞 HDAC1、HDAC2蛋白表达的影响 在TNF-α、LPS作用后HDAC表达降低，而用DXM干预后HDAC表达增强；NAC对HDAC的表达却没有影响，见Fig 4。

2.5 DXM、NAC对A549细胞HDAC活性的影响A549细胞HDAC的活性在未处理组、TNF-α、LPS作用后分别为（19.1±6.14）mol·L-1、（15.19±2.33）mol·L-1和（17.01±6.38）mol·L-1，与未处理组相比TNF-α、LPS作用明显降低细胞HDAC活性（tTNF-α＝0.84，P＜0.05；tLPS＝0.33，P＜0.05）。DXM及NAC作用后细胞HDAC活性分别为（20.05±0.12）mol·L-1和（21.70±6.14）mol·L-1，DXM明显增加细胞 HDAC活性（t＝-0.22，P＜0.05），NAC对细胞HDAC活性无影响（t＝-0.42，P＞0.05）。TSA能明显抑制HDAC活性（t＝1.08，P＜0.05），见 Tab 3。

Tab 3 Effect of A549 cells on activity of HDAC induced byTNF-α，LPS and abolished by NAC and DXM in A549 cells

2.6 DXM、NAC对A549细胞转录因子 NF-κB、AP-1活化的影响 在TNF-α、LPS作用后细胞核活化的NF-κB表达增强，而加入DXM、NAC预处理细胞后再加入TNF-α、LPS刺激细胞，细胞核活化的NF-κB表达明显减弱，见 Fig 5。

Fig 5 W estern blot test effect of A549 cells on NF-KB expression induced by TNF-α，LPS and abolished by NAC and DXM in A549 cellsL：LPS；T：TNF-α；N：NAC；D：DXM

2.7 DXM、NAC对A549细胞转录因子NF-KB、AP-1活化的影响 A549细胞在TNF-α、LPS作用后转录因子AP-1的表达增强，而加入DXM预处理细胞后再加入TNF-α、LPS作用细胞，AP-1的表达减弱；NAC预处理细胞后再加入TNF-α、LPS刺激细胞，NAC预处理组与TNF-α、LPS单独作用组转录因子AP-1的表达作用无明显变化，见Fig 6。

Fig 6 W estern blot test effect of A549 cells on C-jun expression induced by TNF-α，LPS and abolished by NAC and DXM in A549 cellsL：LPS；T：TNF-α；N：NAC；D：DXM

3 讨论

慢阻肺的主要病理特征是肺组织和气道的慢性炎症，贺蓓等［4］研究发现：IL-8存在于气道炎症的始终，起着引发、维持甚至加重气道炎症的重要作用。ICAM-1是体内重要的黏附分子［5］。当刺激因子如IL-1、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、脂多糖（LPS）等炎性介质激活血管内皮细胞，使其上调表达ICAM-1，可以增加内皮细胞对中性粒细胞的黏附作用，促进中性粒细胞在组织内的集聚和浸润［6］。DXM是治疗多种炎症性疾病的常见药物，大量体内外实验表明DXM对多种炎症相关的细胞因子、黏附分子、酶受体的表达有明显拮抗作用［7］。我们的研究结果表明：TNF-α诱导 A549细胞炎症因子 IL-8及ICAM-1的表达。而DXM能够明显抑制TNF-α诱导的 A549细胞炎症因子 IL-8、ICAM-1的表达［8］。本文结果证明糖皮质激素具有良好的抗炎作用。

针对糖皮质激素抗炎作用机制的研究表明：激素易于通过细胞膜进入细胞，与胞质内的激素受体（GR）结合。随之激素-受体复合易位进入细胞核，进而对炎症细胞和分子产生影响而发挥抗炎作用［9］。我们的结果显示：DXM作用于A549细胞后，与位于细胞质的激素受体结合，导致GR入核增加，提示糖皮质激素通过与GR结合入核后发挥抗炎作用。

真核生物DNA表达有赖于转录激活，与组蛋白乙酰化酶（Histoneacetyltransferase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase，HDAC）的活性紧密相关。HAT使核小体中组蛋白-DNA的结合变得松散，利于RNA聚合酶的结合，促进炎症因子如IL-8、ICAM-1等的转录和合成，促进炎症反应的发生，而HDAC的作用正相反，抑制炎症因子的转录和合成，抑制炎症反应［10-11］。研究表明［2-3］：糖皮质激素与GR结合转移至细胞核，募集HDAC形成复合体，促进组蛋白去乙酰化，抑制相关基因转录。我们的研究数据表明：10-5、10-6、10-7、10-8mol·L-1的DXM分别作用于A549细胞后，其HDAC1、HDAC2蛋白表达均有不同程度的增强，HDAC抑制剂TSA能明显降低HDAC的表达；针对HDAC活性的测定结果显示：致炎因素TNF-α下调细胞HDAC的活性，而DXM作用于细胞后能明显增加HDAC的活性，而且DXM预处理细胞能明显拮抗TNF-α下调细胞HDAC活性的作用，此结果与免疫印迹的结果一致，提示DXM通过增加HDAC的活性及蛋白表达形成抗炎复合体，进入细胞核后通过促进组蛋白去乙酰化酶的作用，抑制相关基因的转录。

转录因子AP-1和NF-κB是涉及炎症基因转录的重要转录因子，有研究表明［12］：糖皮质激素与GR结合后入核募集HDAC，从而抑制转录因子的转录活化，抑制炎症相关基因的表达。GCs一方面通过其受体直接与 RelA（NF-κB异源二聚体的 p65亚基）相互作用，抑制NF-κB与DNA结合，阻断其调控作用；另一方面是增加 NF-κB抑制蛋白 IκB基因的转录，抑制 NF-κB活性，从而发挥抗炎作用［13-14］。我们的研究结果显示：致炎因素 TNF-α、LPS明显上调A549细胞转录因子AP-1和NF-κB的转录活性，DXM明显抑制TNF-α、LPS诱导下的转录因子AP-1和NF-κB的转录活化作用。提示：DXM对转录因子的活化有明显的抑制作用。

对于慢阻肺患者，DXM不能有效的缓解肺功能的下降速率，对慢阻肺慢性持续性的炎症过程无明显改善［15-16］。提示慢阻肺可能存在一定程度的激素抵抗［17］，且糖皮质激素副作用大，我们需要研发更多的有效控制慢阻肺慢性炎症的药物。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种经典的化痰药物。近年来随着研究的深入，发现NAC不仅具有黏液溶解作用，而且具有较强的抗氧化作用和促进表面活性物质生成等作用，NAC作为GSH的前体，是一种含有巯基的化合物，且含有促进还原型GSH生物合成的半胱氨酸，具有清除氧自由基、调节细胞的代谢活动，预防DNA损伤、调整基因的表达和信号转导系统、抗细胞凋亡、抗血管生成、抑制恶性肿瘤发展等作用［18］。Blasi等［19］研究发现抗氧化剂 NAC能减少慢阻肺患者的发病次数、病情的恶化程度和发病的天数、减缓肺功能的下降速度。Su等［20］研究也发现NAC能减少细菌在支气管的繁殖及减缓病程的进展，改善患者的肺功能、临床症状和生活质量。本研究结果还显示：NAC具有良好的抗炎作用，其能抑制致炎因素TNF-α诱导IL-8、ICAM-1的表达。我们研究结果还显示：NAC对 A549细胞 HDAC1、HDAC2的蛋白表达无影响，对HDAC细胞活性无影响。同时，NAC对糖皮质激素受体入核过程亦无影响。但是，研究结果显示：NAC有明显抑制转录因子NF-κB转录活化的作用，但对于转录因子AP-1的转录活化没有影响。因此，我们的研究结果表明：NAC与糖皮质激素的抗炎机制完全不同，NAC并没有通过影响乙酰/去乙酰化信号机制抑制炎症因子的表达，我们推测NAC的抗炎作用与其影响氧化/抗氧化平衡有关，并可能通过此路径来发挥抗炎作用。

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