尼可地尔、谷氨酰胺、美托洛尔单独及合用对大鼠心肌缺血/再灌注损伤后心肌细胞抗凋亡和HSP70的影响

陈文华，孙 畅，张 颖，吴艳娜，温 克，康 毅，娄建石

（天津医科大学基础医学院药理学教研室，天津 300070）

心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）即当心肌较长时间缺血造成一定程度损伤后，恢复供血不但不能减轻或逆转损伤，反而加重损伤。MIRI表现为心肌舒缩功能降低、心肌结构损坏、心律失常、心肌能量代谢障碍和超微结构变化等。1986年，Murry等首次提出“缺血预适应”（ischemia preconditioning，IPC）的概念，即反复短暂的心肌缺血会对心肌产生保护作用，使心肌对更长时间缺血的耐受性增强［1］。目前认为，IPC是一种非常有效的内源性保护机制，可刺激机体合成、释放内源性活性物质。基于对这种保护性机制的认识，研究人员用药物激发或模拟机体内源性活性物质，以呈现IPC样保护作用，称为药理性预适应（pharmacological preconditioning，PP）。缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤的发生机制较为复杂，但目前国内外报道的药理性预适应大多仍是单药物、单机制、单方面的。所以，针对这种情况，研究人员开始尝试联合用药防治I/R损伤。细胞凋亡是MIRI的特征性改变［2-3］，细胞凋亡的数量决定着I/R损伤的轻重。热休克蛋白［4］（heat shock protein，HSP）是机体在多种损伤性应激原（如热休克、缺血、创伤、病原体感染）应激状态下产生的一类内源性保护蛋白。HSP70作为其中一个亚型，在防止应激引起的细胞损害以及修复受损的细胞方面发挥着重要的作用［5］。因此，本实验采用尼可地尔、美托洛尔、谷氨酰胺三种药物，观察单独用药与联合用药对大鼠MIRI后心肌细胞抗凋亡能力和保护性蛋白HSP70表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要药品与试剂 尼可地尔（陕西力邦制药公司，批号：030604）；美托洛尔（天津市药物研究院，批号：091203）；丙氨酰谷氨酰胺注射液（华瑞制药有限公司，批号：80DK32）；RIPA组织/细胞裂解液（北京普利莱基因技术有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，批号：201211043）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天，批号：201201022）；鼠单克隆抗体β-actin（Santa Cruz）；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根酶标记山羊抗兔IgG、兔抗鼠Bcl-2均购自 Santa Cruz（批号分别为：96996、97380、J2511）；兔抗鼠Bax（Abcam分装，批号：70163）；原位细胞凋亡检测试剂盒（Roche，德国）；蛋白酶 K（Roche，德国）；鼠单克隆抗体 HSP70（Santa Cruz，批号：3097-100）。

1.1.2 仪器 BL-420S生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；HX-100E小动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）；外科手术器械（上海医疗器械有限公司）；电泳仪和电泳槽（BIO-RAD，USA）；WK-9580B型水平摇床（北京六一仪器有限公司）；2050型自动石蜡切片机（Sigma，德国）；H22110型切片烘干机（Leica，德国）。

1.1.3 实验动物及分组 Wistar♂健康大鼠104只，体质量（250±10）g，SPF级，实验动物质量合格许可证号：SCXK-（军）2012-0004，由军事医学科学院实验动物中心提供。将大鼠随机分为7组。①假手术组（Sham group，n＝8）：麻醉后开胸手术前，腹腔注射 NS（5ml·kg-1，与给药组等体积），30min后实施开胸手术、冠状动脉LAD穿线，不结扎；②缺血/再灌注损伤组（I/R group，n＝16）：麻醉后开胸手术前，腹腔注射NS（5 ml·kg-1，与给药组等体积），30 min后实施I/R程序；③ 尼可地尔组（Nic group，n＝16）：麻醉后开胸手术前，腹腔注射给予1 mg·kg-1即 1 ml·kg-1（药物浓度为 1 g·L-1）的Nic＋4 ml·kg-1NS，30 min后实施 I/R程序；④ 谷氨酰胺组（Glu group，n＝16）：麻醉后开胸手术前，腹腔注射给予1 mg·kg-1（药物浓度为1 g·L-1）的 Glu＋4 ml·kg-1NS，30 min后实施 I/R程序；⑤美托洛尔组（Met group，n＝16）：麻醉后开胸手术前，腹腔注射给予1mg·kg-1即1ml·kg-1（药物浓度为 1 g·L-1）的 Met＋4 ml·kg-1NS，30 min后实施I/R程序；⑥ 三药联用组（NGM group，n＝16）：麻醉后开胸手术前，腹腔注射给予1 ml·kg-1Nic＋1 ml·kg-1Glu＋1 ml·kg-1Met＋2 ml·kg-1NS，30 min后实施I/R程序；⑦三药联用低剂量组（NGML group，n＝16）：麻醉后开胸手术前，按 NMG组剂量的1/2腹腔注射给药，30 min后实施I/R程序。

1.2 方法

1.2.1 心肌缺血/再灌注损伤模型的建立 ♂Wistar大鼠用25%乌拉坦（1 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，仰位固定于手术台。连接BL-420S生物机能实验系统，监测体表心电图。行颈总动脉插管、气管插管，连接小动物呼吸机。于胸骨左缘3 mm处纵向剪开胸部皮肤，钝性分离肌肉，止血钳于第4、5肋间开胸，剪开心包，暴露心脏。以左冠状静脉为标志，从左心耳下缘1 mm处进针，经LAD下，于肺动脉圆锥旁出针。收紧结扎线，阻断LAD血流，造成心肌缺血；心肌缺血30 min后，松开结扎线，恢复血液灌注，进行再灌注2 h程序。

1.2.2 药物预处理（PP）模型的建立 大鼠麻醉后，腹腔注射给予相应的药物，观察并记录心电图变化，30 min后行开胸手术，实施心肌缺血30 min，再灌注2 h程序。

1.2.3 TUNEL法检测细胞凋亡 心脏LAD冠脉再灌注120 min时迅速取下心脏，取中下1/3部分于10%中性福尔马林溶液中固定，用于检测细胞凋亡。经TUNEL染色，凋亡阳性心肌细胞核被染成棕黄色，非凋亡心肌细胞核为蓝色。每只大鼠观察2张切片，每张切片分别计数5个高倍镜视野（400×）中的凋亡阳性细胞核数和总细胞核数，并各取平均值，凋亡阳性细胞核数与总细胞核数的比值作为心肌细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）。

1.2.4 Western blot法检测大鼠心肌细胞Bcl-2、Bax、HSP-70的表达 心脏LAD冠脉再灌注120 min时迅速取下心脏，垂直于心脏长轴方向，取中上2/3左心室前壁心肌组织用于检测。

1.2.5 统计学方法 计量资料以¯x±s表示，均数间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。单因素方差分析总体上存在显著性差异，方差齐时，组间比较采用LSD法；方差不齐时，采用秩和检验法。所有分析均使用SPSS 17.0统计软件分析。

2 结果

2.1 尼可地尔、美托洛尔、谷氨酰胺单独及联合用药对大鼠I/R损伤后心肌细胞凋亡的影响 I/R组中有大量的凋亡细胞，单用及联合用药组中凋亡细胞则明显减少。I/R组细胞凋亡率明显高于Sham组，表明I/R损伤后细胞凋亡明显；而NGM组细胞凋亡率明显低于I/R组，表明联合用药可以抵抗I/R损伤引起的细胞凋亡；与药物单用组相比，NGM组细胞凋亡率明显降低，表明联合用药可以从多个方面抑制细胞凋亡。见Fig 1，2。

2.2 尼可地尔、美托洛尔、谷氨酰胺单独及联合用药对大鼠I/R损伤后Bcl-2、Bax表达的影响 I/R组与Sham组相比Bcl-2的表达较少，各药物预处理组与I/R组相比Bcl-2的表达均明显增加，但与药物单用组相比，NGM组Bcl-2表达增加更多；I/R组较Sham组Bax表达明显增加，药物预处理组与I/R组相比Bax表达均明显降低，与药物单用组相比，NGM组和NGML组Bax表达更低（P＜0.01）；I/R组的Bcl-2/Bax值最小，约为Sham组的22%；药物预处理组的Bcl-2/Bax值均有所增加，以NGM组增幅最大，且与单用药物组以及NGML组的差异存在统计学意义。见Fig 3～5。

Fig 1 Changes of apoptosis determ ined by TUNEL in rat cardiomyocytes after I/R injury in each experimental group（400×）A：Sham；B：I/R；C：Nic；D：Glu；E：Met；F：NGM：G：NGML.

Fig 3 Bcl-2 andβ-actin ofm yocardial cells by W estern blot

Fig 4 Bax andβ-actin ofmyocardial cells by Western blot

Fig 5 Changes of Bcl-2/Bax in rat cardiomyocytes after I/R injury in each experimental group**P＜0.01 vs sham；△△P＜0.01 vs I/R；＃＃P＜0.01 vs NGM

2.3 尼可地尔、美托洛尔、谷氨酰胺单独及联合用药对大鼠I/R损伤后HSP 70表达的影响 与Sham组相比，I/R组HSP70的表达略有增加；与I/R组相比，各药物单用组以及联合用药组HSP 70的表达均明显增加，尤以NGM组增幅最大，约为I/R组的2.4倍。见Fig 6，7。

Fig 6 HSP 70 andβ-actin ofm yocardial cells by W estern blot

3 讨论

细胞凋亡是1972年由Kerr教授根据形态学特征首先提出的，它是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡［6］。细胞凋亡有着非常复杂的调控机制，其中Bcl-2基因家族是目前研究较多的与细胞凋亡密切相关的基因，Bcl-2与Bax基因均属于Bcl-2基因家族，但两者的作用相反，Bcl-2为抑制细胞凋亡的基因，而Bax为促进细胞凋亡的基因。研究结果表明，Bcl-2/Bax比值的大小可反映Bcl-2和Bax在细胞凋亡中的作用，若Bcl-2/Bax比值较高，则抑制细胞凋亡；反之，Bcl-2/Bax比值较低，则促进细胞凋亡［7-8］。本实验采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡率［9］；Western blot法检测凋亡调节蛋白和心肌细胞HSP70的表达，评价I/R过程中联合用药预处理对细胞凋亡的保护作用。本实验研究结果显示：I/R组缺血区的细胞凋亡率较高，采用药物预处理可以降低细胞凋亡率；I/R组凋亡相关蛋白表达Bcl-2/Bax值较低，采用药物预处理组可以使Bcl-2/Bax值升高。由此结果我们可以看出，尼可地尔、谷氨酰胺、美托洛尔单独及联合用药可以减少大鼠心肌缺血/再灌注损伤后心肌细胞的凋亡。

MIRI过程中细胞凋亡的主要机制［10］为：①凋亡相关基因的调控，如Bcl-2家族、p53、Fas抗原等；②中性粒细胞浸润、氧自由基损伤、细胞内钙超载，细胞因子的大量表达等。HSP70发挥保护作用的机制［11-12］主要为：通过结合因缺血而受损的蛋白，修复并维持其结构的稳定性；维护心肌钙离子的稳定；保护心肌线粒体功能；调节敏感性钾通道活性等。

尼可地尔［13］的抗心肌细胞凋亡作用与KATPC的开放有关，它是一种非选择性的KATPC开放剂，可同时开放细胞膜和线粒体内膜上的KATPC［14］。美托洛尔一方面通过抑制心肌细胞β受体，降低心肌收缩力，减慢心率，抑制交感神经和中性粒细胞激活，减轻钙超载，达到抗凋亡作用［15］；另一方面，美托洛尔能减少Fas、caspase-3、p53等凋亡相关蛋白的表达。氧自由基是心肌缺血/再灌注损伤的重要因素之一，谷氨酰胺一方面能够通过诱导谷胱甘肽的合成保护心肌细胞免受氧化应激的损伤，另一方面也能够提供谷胱甘肽的前体从而增加心肌组织氧自由基的清除，有利于心肌缺血/再灌注后心肌细胞的恢复；许多研究表明，谷氨酰胺还可以增加HSP的表达，达到对抗应激刺激起到保护细胞的［16］。HSP70对细胞凋亡的死亡受体通路和线粒体通路均有抑制作用［17］。

综上所述，联合用药通过增加氧自由基的清除，减轻心肌细胞钙超载，保护线粒体，调节凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达，诱导心肌缺血预适应，增加保护性蛋白HSP70的表达等途径作用在心肌缺血/再灌注损伤的各个环节；从缺血预适应、心肌细胞能量代谢和抑制细胞凋亡三个层面，达到协同抗凋亡作用。

Fig 7 Changes of HSP protein expresion determ ined by Western blot in rat cardiomyocytes after I/R injury in each experimental group（%ofβ-actin）**P＜0.01 vs Sham；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R；＃＃P＜0.01 vs NGM

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