乌鲁木齐某农场沙门氏菌的分离鉴定

彭永刚，于 倩，刘建华

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150001；2.新疆农业大学动物医学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

沙门氏菌是一种肠道杆菌，广泛存在于各种动物及其环境之中。沙门氏菌病不仅是影响当今养禽业的主要细菌性疾病[2]，也是一种人畜共患性疾病，可导致严重的食品安全问题[3]。以肺部感染为特征的疾病主要危害 20 日龄以内的鸡群[4]，0～12 日龄为发病死亡高峰期[5]。到30 日龄以后 ，症状逐步减轻或消失 ，但遗留的弱残鸡 ，使育雏期淘汰率增加。因此，鸡舍环境条件差、密度大、通风不良、饲料配合不当、营养缺乏等亦可引起本病的发生。

本研究从新疆乌鲁木齐某养鸡场暴发的病例的送检病料中分离到一株疑似沙门氏菌，经PCR、生化实验和动物回归实验确诊为鸡白痢沙门氏菌，并对其进行了药敏试验，以期为该病的防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

采自某鸡场，临床表现为精神萎顿，食欲减少，同时腹泻，排稀薄如浆糊状粪便，有的病雏出现眼盲，或肢关节呈跛行症状的患病雏鸡。剖检可见肝肿大，充血或有条纹状出血，有的心肌、肺、肝、盲肠、大肠及肌胃肌肉中有坏死灶或结节。具有明显病变雏鸡的肝脏、心脏、肺等组织作病原分离。

1.1.2 试验材料

普通琼脂培养基、三糖铁培养基（TSI）、蛋白胨、葡萄糖蛋白胨、V-P试剂、M-R试剂、药敏试纸均由鸡场微生物实验室提供，以上试剂均在有效使用期内；rTaq、dNTP购自大连宝生物公司；Animal Tissue Direct PCR Kit购自成都福际生物技术有限公司；实验动物20 日龄以内的SPF雏鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养

采集病、死鸡的肝脏、心脏、肺等组织，接种在普通营养琼脂培养基上，37℃培养 18-24h。

1.2.2 涂片、革兰氏染色及镜检

取新鲜可疑菌落，进行涂片、革兰氏染色、镜检。

1.2.3 药敏试验

用灭菌棉拭子蘸取该分离菌营养肉汤纯培养物，在普通琼脂培养基表面反复涂布3次，室温干燥3-5 min。后用无菌小镊子将上述抗菌药物纸片分别贴于培养基表面（每换一种纸片都要灭菌一次镊子），37 ℃ 培养24 h。根据药敏纸片周围有无抑菌圈及其直径大小来判断该菌对各种药物的敏感程度，分为高度敏、中度敏感、低度敏感、不敏感（耐药）没有抑菌圈。

1.2.4 生化实验

将分离到的菌按常规方法进行三糖铁试验、吲哚试验、MR试验和 VP试验以及多种糖发酵试验。

1.2.5 PCR鉴定

参照文献[6]，设计合成沙门氏菌invA基因核苷酸序列引物：invA1：5’-CGGTGGGGTTT GTTGTCTTTTC-3’，invA2： 5’-TCTCTTTCCA GTTCGCTTCGCC-3’、扩增产物长度为202 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。PCR方法参见文献[6]，PCR产物用Dye terminator Cycle Sequecing Quick Start Kit进行测序反应。应用DNAStar分析软件进行序列的数据编辑，并对测序基因的核苷酸进行分析。

1.2.5 动物回归实验

取健康雏鸡接种后观察并记录发病情况及死亡时间 ，取接种鸡的肝及心血进行病原的再分离。

2 结果

2.1 菌落形态及培养特性结果

在琼脂培养基上进行培养，肉眼可见形成圆形、隆起、灰白色的半透明菌落。经镜检发现该分离菌为无芽孢、直杆状革兰氏阴性杆菌（图1）。

图1 沙门氏菌菌落形态

2.2 生化实验结果

生化实验结果见表1。由表中结果可见其生化特性与鸡白痢沙门氏菌相符。

表1 沙门氏菌生化试验结果

2.3 药敏试验结果

根据药敏纸片周围有无抑菌圈及其直径大小，本实验经药敏试验结果显示，分离得到的沙门氏菌对庆大霉素，氯霉素高度敏感；对氧氟沙星、环丙沙星、青霉素、复方新诺、痢特灵低敏。

2.4 PCR结果与分析

应用设计的引物，参照Animal Tissue Direct PCR Kit操作说明进行PCR，实验结果显示在约200bp出现目的条带，与预期大小相符（图2）。PCR产物经测序分析显示其与GENEBANK中登录的鸡白痢沙门氏菌invA基因序列同源性99.7%。初步判定其为沙门氏菌。

图2 PCR结果

2.5 动物回归试验结果

将培养菌液接种于雏鸡24 h后，出现精神不振、食欲减退等症状，最后死亡。解剖死亡雏鸡，主要病变有： 肝脏肿大，质脆、出血、呈土黄色，有粟粒大灰白色坏死灶，胆囊扩张，脾脏肿大、出血，卵黄吸收不良，肺脏充血，出现肺炎等病理变化，将所分离细菌接种后，24h后长出与前述分离菌特征一致的细菌。

3 讨论

鸡的沙门氏菌病在各日龄均可感染，沙门氏菌还能垂直传播。若种鸡带菌，则所产种蛋也可带菌，因此孵化场在种蛋孵化前应对种蛋外壳严格进行消毒处理。为防止因雏鸡带菌在注射疫苗时的交叉感染，因此建议在免疫过程中尽量做到一只鸡（或一个最小单位的鸡群）用一个针头[7]，以减少病菌的传播。

本病的发生与饲养管理有密切关系 ，如雏群拥挤、温差过大、通风不良、饲料营养不全等均可引发本病。建议加强饲养管理、注意环境卫生 ，并做好隔离、封锁和消毒工作。购买雏鸡一定要对孵化场进行考察了解，不要向近期有沙门氏菌污染的孵化场购买雏鸡，而且对购进的雏鸡应进行精心管理，发现死雏，及时检查，查找死亡原因。对已感染沙门氏菌的鸡，要采取果断措施[8]。作为种鸡场，如果饲养数量不是很多，应全群淘汰，并对鸡舍、场地、用具等进行彻底清扫，消毒杀菌，鸡舍空置2周以上才能引进下一批鸡。商品鸡场若发现有沙门氏感染鸡，应及时淘汰病鸡，对未发现病鸡进行药物预防。感染沙门氏菌的成年鸡虽然能够产蛋，但所产鸡蛋可能带菌[9]，因此要进行杀菌处理，方可出售。

本研究通过PCR克隆了沙门氏菌invA基因序列，该基因高度保守，可作为沙门氏菌的鉴别检测，通过序列分析发现其与鸡白痢沙门氏菌invA基因高度同源，可初步判定分离得到的菌株为鸡白痢沙门氏菌。本实验进一步通过生化实验，对照沙门氏菌生化特征，证实了该菌为鸡白痢沙门氏菌。动物回归实验要注意接种动物的各种变化，做到勤观察，包括呼吸状态、呼吸式等，对死亡的实验鸡只要及时剖检并做相关实验室检测。将该菌分离培养后接种雏鸡，通过动物回归实验证实实验动物临床特征和剖检病理特征符合该鸡场患病雏鸡的发病特征，从而证实本实验分离得到的菌种为该鸡场暴发疾病的病原菌。

在实验过程中，要严格按照实验室相关要求操作。在配制培养基过程中，要严格按照培养基使用说明配制，必须彻底灭菌，不得含有任何活细菌，否则配制的培养基无法达到预期使用效果[10]。药敏实验过程中，用灭菌接种环致密划线于琼脂平板表面时用力要均匀，接种细菌量不能过大。将确定好的药敏纸片分贴到平板表面时，每个纸片都应轻压一下，以保证与平板表面完全接触[12]。药敏实验结果显示分离的沙门氏菌对庆大霉素、氯霉素高度敏感，是治疗该病的首选抗生素。

实验结果确诊了该鸡场暴发的疾病病原为鸡白痢沙门氏菌，同时通过药敏试验得出了防治该病的有效抗生素。本实验为鸡白痢沙门氏菌病的防治提供参考。

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