禽副黏病毒4型荧光RT-PCR检测方法的建立

王静静，刘华雷，王英丽，郑东霞，赵云玲，吕 艳，左媛媛，于松梅，王志亮

（中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032 ）

禽副黏病毒（APMVs）在分类地位上属于副黏病毒科副黏病毒亚科禽腮腺炎病毒属（Avulavirus），其基因组为单股负链RNA，可感染多种禽类。目前的研究表明禽副黏病毒至少包括11个血清型，即APMV-1～APMV-11[1-2]。禽副黏病毒1型（APMV-1）也称为新城疫病毒（NDV），在所有禽副黏病毒中危害最为严重。禽副黏病毒4型（APMV-4）于1975年出现于香港地区的鸭群中[3-4]，此后美国、韩国、比利时、新西兰等国家也监测到该病毒[4-7]。我国大陆地区于2012年首次报道发现APMV-4[8]。APMV-4主要感染雁形目鸟类[5]、家鸭、鸡和鹅[3，9-10]。蛋鸡感染APMV-4后白壳蛋产量增加，但产蛋量不受影响[11]。APMV-4基因组大小约为15054 nt，共编码6种蛋白：核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）和大聚合酶蛋白（L）。鉴于我国在2012年首次出现APMV-4，因此建立一种APMV-4的快速、灵敏和高效检测技术在该病毒的早期发现和快速诊断中意义重大。本研究根据APMV-4的基因组序列，分别设计了针对APMV-4的特异性引物和探针，建立了APMV-4荧光RT-PCR检测方法，初步应用表明本方法特异性强、敏感性高，可用于APMV-4的快速检测。

1 材料与方法

1.1 病毒

Ⅰ类、Ⅱ类新城疫病毒（NDV）、H5、H9亚型禽流感病毒（AIV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、减蛋综合征病毒（EDSV）和APMV-4分离株APMV4/Duck/China/G302/2012均为本实验室保存。

1.2 主要分子生物学试剂

High Pure Viral RNA Kit购 自 Roche公 司；One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit （Perfect Real Time）、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2购自Takara公司。

1.3 引物与探针的设计合成

根据APMV4/duck/China/G302/2012（GenBank序列号：KC439346）及GenBank上禽副黏病毒4型基因序列，针对相对保守区域，利用Primer Premier 5.0软件分别设计了APMV-4的特异性荧光RT-PCR引物和探针，引物、探针的名称和序列见表1。引物和探针均由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 荧光RT-PCR引物和探针

1.4 RNA提取

取新鲜繁殖的病毒鸡胚尿囊液，采用Roche公司生产的High Pure Viral RNA Kit提取病毒分离株RNA。提取的RNA立即用于RT-PCR扩增或者于-80℃保存。

1.5 荧光RT-PCR

以提取的病毒RNA为模板，采用Takara公司 One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit （Perfect Real Time） 配置荧光RT-PCR反应体系，并于LightCycler定量PCR仪进行RT-PCR反应。反应条件为：42℃ 5min；95℃ 10s；95℃ 5s，60℃30s，进行50个循环。

1.6 特异性试验

分别提取NDV（Ⅰ、Ⅱ类）、AIV（H5、H9亚型）、IBV、EDSV以及APMV-4的RNA，进行荧光RT-PCR扩增，并以DEPC处理水作为阴性对照。

1.7 灵敏度试验

用APMV-4的RNA做10倍系列稀释，进行荧光RT-PCR扩增。

1.8 常规RT-PCR

采用APMV-4鉴定引物，利用Takara公司PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2进行常规RT-PCR 扩 增。 上 游引 物 M1：5´-CAACACTTA CGGGTTTATC-3´；下游引物 M2：5´-CTTCTCGC AGTCTATCTTCT-3´，扩增片段长度为331 bp。反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，进行 35个循环；72℃延伸7min。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结果

2.1 体系优化

通过对TaqMan探针浓度、引物浓度、退火温度和时间进行优化后，确定荧光RT-PCR体系的最佳探针浓度为0.2µM、引物浓度为0.4µM、退火温度和时间为60℃ 30s。用优化好的反应体系扩增APMV-4 RNA，并用LightCycler 480软件进行分析，其扩增曲线呈典型的“S”型（图2）。

2.2 标准曲线的建立

取5个不同稀释度的RNA标准品（浓度分别为106～102EID50）进行荧光RT-PCR反应，每个稀释度的标准品做3个重复。以获得的Cp值为y轴，对应标准品的EID50的对数为x轴，制作标准曲线（图1）。标准方程为y = -2.931x + 40.50，相关系数为0.999。

图1 荧光RT-PCR检测RNA的标准曲线

2.3 特异性试验

分别取APMV-4、NDV（Ⅰ、Ⅱ类）、AIV（H5、H9亚型）、IBV、EDSV的RNA，以及DEPC处理水（阴性对照）进行荧光RT-PCR扩增，发现除APMV-4出现特异性扩增曲线外，其余病毒及阴性对照均没有扩增曲线（图2）。

图2 荧光RT-PCR特异性试验结果

2.4 灵敏度试验

取浓度为105～10-1EID50的RNA为模板，进行荧光RT-PCR扩增，发现APMV-4的检测下限为1 EID50（图 3）。

图3 荧光RT-PCR灵敏度试验结果

2.5 与常规RT-PCR敏感性比较

以105～1 EID50的APMV-4 RNA为模板，分别用常规RT-PCR和荧光RT-PCR扩增，发现常规RT-PCR对APMV-4的检测下限为102EID50（图4），荧光RT-PCR的检测下限为1 EID50，比常规RTPCR的敏感性高100倍左右。

图4 常规RT-PCR敏感性检测结果

3 讨论

目前，国外的监测数据显示，已从鸭和鹅等水禽体内分离到APMV-4[4]，而在国内，只是在南方个别省市的监测样品中分离到该病毒。研究显示，APMV-4可在牛肾细胞（MDBK）、幼仓鼠肾传代细胞（BHK21）、鸭胚细胞、非洲绿猴肾细胞（Vero）、鸡胚成纤维细胞（DF-1）和鹌鹑纤维肉瘤细胞（QT35）等多种细胞系上有效复制，说明该病毒的宿主范围十分广泛[12]。然而，目前人们对其病原学、发病禽类的临床表现仍不甚明了，而且，该病在家禽中发病率低，感染禽类的临床症状和剖检病变不明显[13]，仅凭肉眼难以判断，容易出现误诊。目前实验室常用的APMV-4检测方法包括病原分离、RT-PCR试验和血清学试验（如ELISA）等[5，14]，然而，以上方法操作相对复杂、检测周期较长，不适用于大规模的临床样品检测。因此，建立可用于APMV-4快速、灵敏、高效的检测技术十分必要。

与普通RT-PCR方法相比，荧光RT-PCR操作简便、检测时间短，应用该方法检测APMV-4，从RNA提取到获得检测结果可在1.5h内完成，并且在检测过程中可以进行实时监控。荧光RT-PCR方法在结果判定时不需要进行凝胶电泳，不使用溴化乙锭，保障了试验人员的安全，而且，该方法使用仪器收集荧光判定检测结果，也避免了主观因素的影响。

本实验中，根据APMV-4基因保守区域设计特异性引物和探针，在进行荧光RT-PCR检测时，引物和探针的双重保障使得该方法特异性更强，检测结果更准确。而且，本实验应用荧光RT-PCR检测APMV-4的下限为1 EID50，比常规RT-PCR的敏感性高100倍左右。实验证明应用荧光RT-PCR方法检测APMV-4是可行的，该方法适用于临床样本的快速诊断。

荧光RT-PCR也有不足之处，由于其运用了封闭的检测系统，减少了扩增后的电泳检测步骤，因而无法监测扩增产物的大小[15]，而且APMV-4荧光RT-PCR试剂盒和检测探针的成本较高，也限制了其广泛应用于大规模的流行病学调查。

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