多沙唑嗪对映体对大鼠肠系膜微动脉α1受体介导收缩反应的作用

高玲娜，李同荟，赵 静，卢丹丹，任雷鸣

（河北医科大学中西医结合学院，中西医结合研究所，河北石家庄 050017）

消旋多沙唑嗪［racemic-doxazosin，（±）DOX］是一种长效α1受体选择性阻断剂［1］，也是治疗良性前列腺增生（benign prostate hyperplasia，BPH）所致下尿路症状（lower urinary tract symptoms，LUTS）的一线药物［2］。（±）DOX含有等量的左旋多沙唑嗪［（-）DOX］以及右旋多沙唑嗪 ［（+）DOX］［3-4］。在兔离体耳动脉、肠系膜动脉、肺动脉、颈总动脉及胸主动脉，我们首先发现 （-）DOX、（+）DOX和（±）DOX均能拮抗去甲肾上腺素（NA）诱发的血管收缩反应，其中（-）DOX拮抗NA诱发血管收缩的拮抗参数（pA2）明显小于（+）DOX［5-6］。最近我们又发现，（-）DOX和（+）DOX对兔前列腺平滑肌功能性α1A受体的阻断作用强度相同；而（-）DOX对鼠主动脉平滑肌功能性α1D受体的阻断作用明显弱于（+）DOX；特别是（±）DOX和（+）DOX对离体大鼠右心室肌具有显著的负性肌力作用，（-）DOX对大鼠则无明显影响；（-）DOX明显增强大鼠离体左心房肌条的收缩力［7-8］。大鼠连续灌胃给予（-）DOX、（+）DOX和（±）DOX 3个月后，（±）DOX降低清醒大鼠血压的作用明显强于（+）DOX，其中（-）DOX的降压作用十分轻微［9-10］。（-）DOX可能成为心血管不良反应轻微，治疗BPH／LUTS有效的光学纯药物［11-13］。

我们也曾在大鼠肠系膜动脉研究了（-）DOX、（+）DOX及（±）DOX拮抗NA诱发血管收缩的作用，其 pKB值分别为7.985±0.273、9.084±0.319和8.911±0.313［14］。然而，这些用于离体实验的家兔或大鼠的动脉均属于传输血管，其实验结果与清醒大鼠的血压实验结果［10］不完全吻合。因此，本研究采用DMT 620 M微血管张力测定系统，在大鼠离体肠系膜动脉第二级和第三级阻力血管，分析（-）DOX、（+）DOX及（±）DOX对不同直径阻力血管α1受体的阻断作用；以期解释（±）DOX及其对映体降低清醒大鼠血压的可能机制。

1 材料

1.1 仪器 CP213型电子天平，Ohaus Corporation公司；BS210S型电子天平，Sartorius公司；Power-Lab8／35型数据采集系统，AD Instrument Pty Ltd公司；DMT 620 M微血管张力测定系统，丹麦DMT有限公司；146型纯水仪，Thermo公司；SZX7型显微镜，Olympus公司。

1.2 药品 甲磺酸左旋多沙唑嗪原粉、甲磺酸右旋多沙唑嗪原粉、甲磺酸消旋多沙唑嗪原粉（纯度均大于＞0.99），均由华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供。盐酸苯肾上腺素（phenylephrine，

Phe）、盐酸普萘洛尔、盐酸育亨宾、NaCl、KCl、Mg-SO4、NaH2PO4、CaCl2、NaHCO3以及 glucose均购自美国 Sigma-Aldrich（St Louis，MO，USA）公司。

1.3 动物 Wistar大鼠，清洁级，♂，体质量250～350 g，由河北省实验动物中心提供。饲养于室温（23±1）℃，相对湿度0.5±0.05，明暗各12 h的清洁级动物实验室内，自由进食和饮水。适应环境性饲养7 d，实验前12 h禁食。

2 方法

2.1 药品配制 精确称取一定量的甲磺酸（-）DOX、（+）DOX、（±）DOX药粉，加适量超纯水；超声20 min，配制成母液；置阴凉、避光处备用。实验前，取一定量母液，用超纯水倍比稀释成所需浓度的溶液。

2.2 营养液配制 改良K-H液（Krebs-Henseleit solution）成份为（mmol·L-1）：NaCl118.3、KCl4.6、MgSO41.2、NaH2PO41.0、CaCl22.5、NaHCO325.0、glucose 11.1［15］。除 NaHCO3、CaCl2和 glucose于实验前临时加入外，其他成份均配成高浓度母液。实验当日，取适量的各母液，加入超纯水，稀释至所需浓度。配制好的营养液以0.95 O2和0.05 CO2的混合气体充分预饱和，并用盐酸调pH至7.4备用。营养液中含有普萘洛尔（1μmol·L-1）及育亨宾（0.3μmol·L-1）分别阻断 β受体和 α2受体［16］。

2.3 离体肠系膜动脉阻力血管制备 Wistar大鼠，以质量浓度250 g·L-1乌拉坦（1.5 g·kg-1）皮下注射，待动物麻醉后断头放血处死；迅速打开腹腔，从空肠起始端至回肠末端，仔细分离并剪取含肠系膜动脉血管床的全部肠管，置于盛有改良K-H液（4℃冰浴）的硅胶平皿中。在显微镜下找到肠系膜动脉的第二级和第三级分支，小心剪除血管周围的结缔组织，借助测微尺测定两种微动脉在静息状态下的内径。在显微镜下将二级或三级动脉分支剪成2.1 mm或1.8 mm左右的血管段。将一根直径40 μm或25μm、长2 cm的金属丝穿过血管段内腔，固定标本于张力换能器一侧的血管钳上；另取一根直径相同、长1.6 cm金属丝穿过血管段内腔，固定于对侧的血管钳上。轻轻旋转螺旋微调，确认两根金属丝平行放置于微血管内，切勿抻拉损伤微血管。静置5 min后，系统调零。

2.4 实验处理

2.4.1 肠系膜微动脉最适前负荷的确定 待血管张力稳定在零值后，使用LabChart软件的DMT标准化程序，对标本进行标准化处理，得出最适初始张力，并将标本调至该张力。平衡45 mim后，建立5轮（二级血管）或4轮（三级血管）Phe（0.03～300 μmol·L-1）累积给药诱发的收缩反应量效曲线。每轮量效曲线完成后，用改良K-H液反复冲洗标本，直至血管张力达到基线水平。每轮量效曲线间隔45 min。对于二级阻力血管，在建立第2、3、4和5轮量效曲线前30 min，调整微血管张力至5、10、15和20 mN。对于三级阻力血管，在建立第2、3和4轮量效曲线前30 min，调整微血管张力至3、4、5和6 mN。

2.4.2 （±）DOX及其对映体对Phe诱发肠系膜微动脉收缩反应的影响 取新鲜肠系膜动脉二级或三级血管标本，给予标准化前负荷。每只大鼠取8个标本，分为4组：溶媒对照组、（-）DOX组、（+）DOX组和（±）DOX组，每组2个标本。各微动脉均建立5轮 Phe累积效曲线（0.03～300μmol·L-1）。每轮量效曲线间隔45min。以第2次Phe量效曲线作为对照，在建立第3、4和5次Phe量效曲线前20 min，依次分别于浴槽中加入0.001、0.01和0.1μmol·L-1浓度的（-）DOX、（+）DOX或（±）DOX，对照组给予溶媒；每个标本只给一种阻断剂。

2.5 统计学处理 药物诱发的血管收缩反应以实测值（mN）的表示。采用加权回归法计算Phe诱发收缩反应量效曲线的-Log EC50值和实测Emax值。不同前负荷下Phe诱发收缩反应量效曲线的统计学分析采用双因素方差分析（two-way ANOVA），当F值有显著性时，则进一步采用Bonferroni′s test检验，比较两对应浓度间的药物效应。采用Gaddum／Schild EC50shift analysis程序计算多沙唑嗪及其对映体的拮抗参数pKB值，其显著性采用组间Student’s t test进行统计学分析。统计分析及图形处理使用GraphPad Prism 5.0软件（San Diego California USA）。

3 结果

3.1 肠系膜动脉二级和三级阻力血管最适前负荷的测定 在静息状态下，二级分支的血管内径为（162.5±5.3）μm（n＝11，mean±SEM），三级分支的内径为（103.1±2.3）μm（n＝23），二者血管内径的差异有显著性（P＜0.01）。LabChart软件的标准化程序测算的肠系膜动脉二级分支血管的标准前负荷为（2.93±0.15）mN（n＝11，mean±SEM），三级分支血管的标准前负荷为（2.64±0.10）mN（n＝23），二者的标准化前负荷无差异（P＞0.05）。肠系膜动脉二级分支血管在5 mN前负荷时，Phe（0.03～300μmol·L-1）诱发收缩反应的量效曲线与标准前负荷条件相比，差异无统计学意义（P＞0.05，Fig 1A）；但是，与标准前负荷相比，当标本的前负荷增加至10、15和20 mN时，Phe诱发的收缩反应的Emax值分别下降了12%、29%和43%（P＜0.01，Fig 1A）。在肠系膜动脉三级分支血管，与标准前负荷相比，当标本的前负荷增加至3、4、5或6mN时，Phe（0.03～300μmol·L-1）诱发收缩反应的量效曲线未见明显改变（P＞0.05，Fig 1B）。

Fig 1 Vasoconstrictive responses to phenylephrine under different preloads in the second branch（A，n＝11）and the third branch（B，n＝23）of the rat mesenteric artery.Points represent themean values and vertical bars show SEM.*P＜0．05，**P＜0．01 vs normalization by Bonferroni’s test.

Fig 2 Effects of solvent（A，n＝15），（-）doxazosin（B，n＝14）；（+）doxazosin（C，n＝14）or（±）doxazosinon（D，n＝12）on phenylephrineinduced vasoconstrictive responses in the second branch of the ratmesenteric artery.Points represent themean values and vertical bars show SEM.

3．2 （±）DOX及其对映体对Phe诱发肠系膜微动脉收缩反应的影响 在大鼠肠系膜动脉二级分支血管标本，建立5轮Phe诱发的收缩反应量效曲线。与第2轮（对照组）收缩反应量效曲线相比，溶媒对后续3轮Phe诱发的收缩反应量效曲线均无明显影响（P＞0.05，Fig 2A）。后4轮收缩反应量效曲线的Emax值为：（15.88±0.25）mN、（15.61±0.23）mN、（16.06±0.33）mN和（16.00±0.25）mN（n＝15，）。在大鼠肠系膜动脉三级分支血管标本，溶媒对Phe诱发收缩反应量效曲线的影响，与二级分支血管的结果相同（P＞0.05，Fig 3A）。后4轮收缩反应量效曲线的 Emax值为：（10.74±0.23）mN、（11.09±0.24）mN、（11.13±0.27）mN和（11.26±0.24）mN（n＝13

0.001～0.1μmol·L-1浓度的（-）DOX（Fig 2B）、（+）DOX（Fig 2C）和 （±）DOX（Fig 2D），分别使Phe诱发的大鼠肠系膜动脉二级分支血管收缩反应量效曲线右移。Schild plot分析结果表明，（-）DOX、（+）DOX和（±）DOX拮抗 Phe诱发收缩反应的斜率分别是：0.75±0.07、0.78±0.04和0.75±0.04，各斜率均明显小于1（P＜0.01，n＝12～14）；表明（-）DOX、（+）DOX和 （±）DOX非竞争性拮抗Phe诱发的血管收缩反应。三者的pKB值由小到大的排列顺序是：（-）DOX（7.85±0.09）、（±）DOX（8.53±0.09）、（+）DOX（8.67±0.10）；其中（±）DOX与（-）DOX相比、（+）DOX与（-）DOX相比，差异均具有统计学意义（P＜0.01，n＝12～14）。

Fig 3 Effects of solvent（A，n＝13），（-）doxazosin（B，n＝11）（+）doxazosin（C，n＝11）or（±）doxazosin（D，n＝11）on phenylephrine-induced vasoconstrictive responses in the third branch of the ratmesenteric artery.Points represent themean values and vertical bars show SEM.

同浓度（-）DOX（Fig 3B）、（+）DOX（Fig 3C）和 （±）DOX（Fig 3D），分别使Phe诱发的大鼠肠系膜动脉三级分支血管收缩反应量效曲线右移。Schild plot分析结果表明，（-）DOX、（+）DOX和（±）DOX拮抗Phe诱发收缩反应的斜率分别是：1.01±0.23、0.87±0.12和0.64±0.06；其中（-）DOX和（+）DOX的斜率与1相比，差异无统计学意义（P＞0.05，n＝11）；表明（-）DOX和 （+）DOX在三级分支血管竞争性拮抗Phe诱发的血管收缩反应。三者的pKB值由小到大，分别为（-）DOX（7.48±0.14）、（+）DOX（8.48±0.10）、（±）DOX（8.68±0.17）。4 讨论

本课题组最近报道，大鼠连续灌胃给予（-）DOX、（+）DOX和（±）DOX 3个月后，（±）DOX降低清醒大鼠血压的作用明显强于（+）DOX，而（-）DOX的降压作用十分轻微；研究结果提示，（-）DOX与（+）DOX在降低清醒大鼠动脉血压方面，可能存在协同效应［10］。在大鼠离体尾动脉标本，DOX及其对映体拮抗NA诱发血管收缩的pKB值分别是（-）DOX（8.032±0.039）、（+）DOX（8.995±0.032）和（±）DOX（8.694±0.032），其中不仅（-）DOX阻断尾动脉 α1受体的作用明显小于（+）DOX，而且（±）DOX阻断尾动脉α1受体的作用亦明显小于（+）DOX［10］。在大鼠离体胸主动脉，DOX及其对映体竞争性拮抗NA诱发血管收缩，它们的pA2值分别是（-）DOX（8.625±0.053）、（+）DOX（9.503±0.051）和（±）DOX（9.236±0.054），同样，不仅（-）DOX阻断胸动脉α1受体的作用明显小于（+）DOX，而且（±）DOX阻断胸主动脉α1受体的作用亦明显小于（+）DOX［7］。我们也曾在大鼠肠系膜动脉研究了（-）DOX、（+）DOX及（±）DOX拮抗NA诱发血管收缩的作用，其pKB值由大至小的排列顺序是（-）DOX（7.985±0.273）、（±）DOX（8.911±0.313）、（+）DOX（9.084±0.319）［14］。然而，这些用于离体实验的家兔或大鼠的动脉均属于传输血管，其实验结果与清醒大鼠的血压实验结果［10］不完全吻合。因此，本研究采用DMT 620 M微血管张力测定系统，在大鼠离体肠系膜动脉第二级和第三级阻力血管，分析（-）DOX、（+）DOX及（±）DOX对不同直径阻力血管α1受体的阻断作用；以期解释（±）DOX及其对映体降低清醒大鼠血压的可能机制。

在本实验中，我们预先应用普萘洛尔和育亨宾分别阻断了微血管的 α2受体和 β受体［16］，因此Phe仅通过激动α1受体诱发血管收缩反应。使用0.001～0.1μmol·L-1浓度的（-）DOX、（+）DOX和（±）DOX预处理微血管标本后，Phe诱发的收缩反应量效曲线随着DOX浓度的升高而逐渐向右侧偏移。在大鼠离体肠系膜动脉第二级阻力血管，（-）DOX、（+）DOX和（±）DOX非竞争性拮抗Phe诱发收缩反应；三者的pKB值由小到大的排列顺序是：（-）DOX（7.85±0.09）、（±）DOX（8.53±0.09）、（+）DOX（8.67±0.10）。然而，对于大鼠离体肠系膜动脉第三级阻力血管，（-）DOX和（+）DOX竞争性拮抗Phe诱发收缩反应；三者的pKB值小到大的排列顺序是：（-）DOX（7.48±0.14）、（+）DOX（8.48±0.10）、（±）DOX（8.68±0.17）。与大鼠胸主动脉和尾动脉不同，（+）DOX及（±）DOX阻断α1受体介导微动脉血管收缩的作用差异无统计学意义；特别需要指出的是，随着微动脉血管直径变细，（±）DOX阻断α1受体的活性有逐渐增强趋势（pKB值由8.53±0.09升至8.68±0.17），而（+）DOX阻断α1受体的活性有逐渐减弱趋势（pKB值由8.67±0.10降至8.48±0.10）。一般观点认为，外周阻力血管的张力变化决定了动脉血压的水平；α1受体阻断剂通过阻断支配外周阻力血管的交感神经递质NA，对血管平滑肌α1受体的激动作用，而降低动脉血压。理论上讲，肠系膜动脉三级阻力血管对动脉血压的调控更为重要。在肠系膜动脉三级阻力血管上，我们发现（±）DOX阻断α1受体介导血管收缩的pKB值大于（+）DOX。该实验结果与以往在传输血管观察的实验结果相反；在大鼠肠系膜微动脉，（-）DOX阻断α1受体的活性明显低于（+）DOX和（±）DOX。尽管（+）DOX和（±）DOX阻断α1受体的活性差异无显著性，在血管三级分支（±）DOX的作用有增强的趋势。

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