Tuftsin衍生物TP影响肿瘤相关巨噬细胞 M IP-1α分子表达

安映红，贾 娜，李琳娜，韩 苏，杨德宣，袁守军

（1.空军总医院临床检验中心生化室，北京 100142；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理，北京 100850）；3.南开大学药学院，天津 300071）

Tuftsin是机体脾脏产生的一段生理活性肽［1］，由苏-赖-脯-精氨酸（Thr-Kys-Pro-Arg，TKPR）组成的一级结构，具有促吞噬活性，所以命名为促吞噬肽［2］。早期研究表明，Tuftsin具有一定的抗肿瘤活性［3］。然而，由于其较短的肽链及体内半衰期使得其至今难以成药并应用于临床。T肽（T peptide，TP）是本课题组和制药公司共同研发的创新抗癌药［4-5］，结构为由赖氨酸将4个Tuftsin样结构连接在一起组成。药物代谢动力学研究表明，TP具有较长的体内半衰期［5］。前期药效评价结果证明，TP对术后残瘤具有明显的抗癌活性［6-8］。对TP作用机制的研究有助于深刻理解TP的术后抗癌过程。肿瘤间质中浸润的巨噬细胞即肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAMs）是肿瘤组织中浸润的一群重要免疫细胞，在肿瘤微环境的调控下TAMs可以转换表型，演变为抑制肿瘤生长的M1型和促进肿瘤进程的M2型［9-10］。前期研究已经证实TP能刺激巨噬细胞并转化其在肿瘤微环境中的细胞表型发挥抗癌作用。巨噬细胞分泌产生巨噬细胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein，MIP-1α），MIP-1α又名 CCL3，是趋化因子配体 3，参与炎症及吞噬细胞的活化、趋化，参与组织修复，肿瘤组织中常能检测到其表达增加。有文献报道［11］，MIP-1α可促进瘤细胞生长，增值，存活，在人软骨肉瘤中MIP-1α在刺激剂的作用下还可诱导细胞迁移［12］，是抗肿瘤研究的一个重要靶点。因此，TP既然能通过巨噬细胞发挥抗癌活性，那么也有可能对MIP-1α有调节作用，本研究旨在探讨MIP-1α是否是TP抗癌过程中的一个重要靶点，从而为TP抗癌作用机制提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 昆明小鼠，♀，4～6周龄，体质量18～22 g，购于军事医学科学院动物中心，并在军事医学科学院动物中心饲养，小鼠食用专用饲料，自由饮水，每日光照12 h，实验室温度保持在25℃左右，相对湿度约40%-70%。小鼠巨噬细胞Ana-1细胞株由本实验研究室传代保存。TP为白色冻干粉末，纯度＞98%，由北京中天康泰生物科技有限公司提供，使用前生理盐水稀释。抗小鼠MIP-1α单克隆抗体购自武汉博士德公司。反转录（RT）反应试剂盒购买于美国Promega公司。Ⅳ型胶原酶购于美国 In-vitrogen公司，透明质酸酶，DNA酶Ⅰ购于华美生物工程有限公司。配制消化液：1 g·L-1Ⅳ型胶原酶，1%透明质酸酶和0.25%DNA酶Ⅰ。

1．2 TAM s细胞分离 建立小鼠S180术后残瘤模型，待肿瘤生长至500～800 mm3时，无菌分离新鲜残瘤组织，生理盐水清洗3～5次，剪成1～3 mm3的小块。37℃用消化液消化肿瘤组织块3 h，制备成单细胞悬液，PBS洗涤2～3次，接种到培养皿中，置于37℃，5%CO2培养箱2 h。然后将未贴壁细胞弃掉，PBS洗涤2～3次，贴壁细胞即为肿瘤相关巨噬细胞［14］。

1．3 RT-PCR实验 收集Ana-1、TAM或不同浓度TP处理的Ana-1或TAM约500万个细胞，提取细胞总RNA，测定RNA含量和纯度。20μl的反转录体系为：1μg RNA加1μl OligodT，配相应体积的无RNA酶水，70℃变性5 min后置于4℃，然后加入5×Prime Buffer 4μl，MgCl22.4μl，dNTP（2.5 mmol·L-1）4μl，Rnasin（20U）0.5μl，RTase 1μl，3.1μl无RNA酶水。反转录条件：37℃反应15 min，85℃加热5min灭活反转录酶，然后置于4℃。反转录的cDNA产物进行PCR反应，反应条件为：94℃变性5 min；然后经94℃变性30 s，55℃退火30秒，72℃延伸1min，进行30个循环，再72℃延伸5min。1%琼脂糖电泳检测PCR产物。引物序列由美国Invitrogen公司合成。β-actin上、下游引物序列为5′-TCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′和 5′-GGTCAGGATCTTCATGAGGT-3′；MIP-1α上、下游引物序列为 5′-TCACCTGCTCAACATCATG-3′和 5′-TCAGGCATTC AGTTCCAGCT-3′。

1.4 小鼠异种移植瘤双瘤手术模型的建立 在小鼠左、右腋下均接种小鼠腹腔抽取的S180肉瘤肿瘤细胞，待小鼠皮下肿瘤生长至约250 mm3时，将其中一侧手术切除部分肿瘤组织，建立术后残瘤模型［4］，左侧腋下肿瘤不作处理。按照残瘤瘤体积大小分组：对照组，阳性药环磷酰胺（CTX）组及TP 8 mg·kg-1组，并于术后次日开始给药，CTX剂量为30 mg·kg-1，给药1次；TP隔天1次，共给药4次。实验结束时分离肿瘤组织。

1．5 免疫组化检测术后残瘤组织中M IP-1α的蛋白表达 手术剥离的肿瘤组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋制成病理切片，免疫组化染色检测MIP-1α的表达。

2 结果

2．1 Ana-1细胞和TAM s的M IP-1α的mRNA表达比较 将对数生长期的Ana-1细胞和原代分离的TAMs提取细胞总RNA，检测并对比 MIP-1αmRNA的表达差别。实验结果表明两种来源的细胞MIP-1αmRNA表达量基本一致，差别没有统计学意义（P＞0.05），如Fig 1所示。结果提示，无论巨噬细胞系，还是原代的巨噬细胞均能高表达MIP-1α。

Fig 1 mRNA expression of M IP-1αin Ana-1 cells and TAM s

2．2 TP对Ana-1细胞M IP-1αm RNA的影响不同浓度TP处理对数生长期的Ana-1细胞72 h后，提取细胞总 RNA，检测 MIP-1αmRNA的表达。如Fig 2所示，与空白对照组相比，3个浓度（0.2、2和20μmol·L-1）的 TP对 Ana-1细胞的 MIP-1αmRNA表达无明显影响，组间差异无统计学意义，P＞0.05。可见TP对建系的巨噬细胞系的MIP-1α的表达无明显影响。

Fig 2 mRNA expression of M IP-1αin Ana-1 cells treated w ith TP

2．3 TP对TAM s的M IP-1αm RNA的影响 不同浓度TP处理原代分离的TAMs 72 h后，提取细胞总RNA，检测MIP-1αmRNA的表达。如Fig 3所示，与空白对照组相比，TP明显降低 TAMs的 MIP-1αmRNA的表达，3个浓度（0.2、2和 20μmol·L-1）与空白组相比差异均有统计学意义，P＜0.01，且呈剂量依赖性。可见对于肿瘤组织中的巨噬细胞，TP有其作用的细胞位点，并能引起巨噬细胞生物学的改变，从而导致一些细胞因子表达发生变化。

Fig 3 m RNA expression of M IP-1αin TAM s treated w ith TP**P＜0.01 vs Control.

2．4 TP对肿瘤组织中M IP-1α蛋白的表达影响为进一步证实上述结果，本研究进行了体内试验以验证TP是否影响MIP-1α蛋白的表达。首先方法中所描述的建立小鼠S180肉瘤细胞双瘤模型，并于肿瘤体积生长至约250 mm3时，在其中一侧建立术后残瘤模型后，然后给予CTX和TP。实验结束时手术瘤和未手术瘤组织均做免疫组化染色，检测MIP-1α蛋白在各个组的表达情况。实验结果如Fig 4，TP处理组的荷瘤小鼠的肿瘤组织MIP-1α与对照组相比表达明显降低，接近于阳性药环磷酰胺组；而且对于同一只小鼠的手术后的残瘤组织与未手术的瘤组织，TP均能降低MIP-1α蛋白的表达。

3 讨论

TAMs可被调控成M1或M2表型，M1型巨噬细胞呈现强的抗原呈递能力，分泌IL-12／23，诱导Ⅰ型免疫应答，产生NO、活性氧等，具有对肿瘤细胞的杀伤能力；M2型巨噬细胞释放免疫抑制因子，促进肿瘤细胞的增殖，演进以及辅助肿瘤细胞远端转移［13］。而肿瘤微环境中浸润的巨噬细胞大多数为M2型［9］。因而，调控肿瘤微环境中的 TAMs，诱导其成为M1型或者使其不被诱导活化为M2型成为研究者热衷的课题。前期实验研究已证实调控巨噬细胞是TP发挥抗癌作用的机制之一，TP可调控TAMs，增强巨噬细胞的吞噬、细胞毒功能，促使TAMs分泌 Th1相关的促炎因子（TNF-α、IL-12、NO、CXCL9、CXCL11等），使其向 M1型极化；还可逆转M2巨噬细胞的表型，增加Th1相关的炎性细胞因子表达［14］。因此，研究TAMs能更深入理解TP抗癌机制。巨噬细胞可产生MIP-1α，其属于趋化因子家族，参与细胞黏附和迁移，在肿瘤发展过程中具有重要作用。TP能够降低肿瘤组织中巨噬细胞MIP-1α的表达，并呈剂量依赖性，说明MIP-1α有可能是TP抗癌作用机制的又一新靶点，更加深入的研究有助于对TP体内抗癌机制的深刻理解。

Fig 4 M IP-1αexpression in tumor tissues

目前，外科手术是实体癌患者的首选治疗方式，但是手术只能最大限度的降低肿瘤负荷，完全消除肿瘤细胞的可能性较小［15］，预防手术后肿瘤复发是临床肿瘤治疗的关键问题。小鼠术后残瘤模型正是在此临床背景下建立的［4］。残瘤模型不仅减轻了肿瘤负荷，而且打破了肿瘤微环境的平衡［16］，打开了肿瘤深度免疫抑制区，使得免疫药物、免疫细胞或免疫因子可以突破肿瘤组织的免疫抑制屏障，从而发挥抗肿瘤作用［4］。小鼠的双瘤模型是在小鼠术后残瘤模型的基础上建立的。双瘤模型既包括了术后残余肿瘤组织，也包括了未手术瘤组织（相当于模拟了临床实际中远端未发觉的微小瘤灶）［4］。利用双瘤模型可以同时检测到在同一生物个体中手术过的肿瘤组织和未手术的肿瘤组织的特点。本实验中使用双瘤模型对同一只小鼠给予TP进行术后治疗，比较未手术瘤和手术瘤的肿瘤组织MIP-1α蛋白的表达情况，能更加全面完整的说明TP对肿瘤组织中MIP-1α的表达影响。

探讨药物药效的体外试验，常使用细胞系作为药物作用的对象，用以初步判定药物作用的效应、方式、环节等；是体内试验的前期预测试，可以节约实验成本，避免不必要的浪费；在药效学研究中也是惯用的操作流程，尤其是在肿瘤药效学研究中可以利用现成的肿瘤细胞系去很好的判定一些细胞毒类药物的药效。然而建系的细胞系由于反复的多次传代或者生长环境的改变，细胞本身的一些生物学特点与原代细胞相比可能已发生改变，对于一些刺激细胞活性或作用于细胞膜表面受体的药物，如本文研究中的Tuftsin或TP，直接作用于细胞系就可能达不到预期的结果。本研究中Ana-1细胞是建系的巨噬细胞系，TAMs是原代巨噬细胞，TP作用于Ana-1细胞并不能影响MIP-1α的表达，而对于TAMs，TP可明显降低体内、外TAMs的MIP-1αmRNA的表达。这些结果说明对于免疫增强剂TP，单纯的体外细胞系试验并不能反映其在体内发生作用的真实情况，药效学评价时，体外实验的阴性研究结果需要慎重对待。TP在动物体内的作用方式、环节较为复杂，涉及很多免疫调控，因此，关于TP抗癌机制还有待进一步探索研究。

参考文献：

［1］ Najjar V A，Constantopoulos A.A new phagocytosis-stimulating tetrapeptide hormone，tuftsin，and its role in disease［J］.J Reticuloendothel Soc，1972，12（2）：197-215.

［2］ Najjar V A，Nishioka K.“Tuftsin”：a natural phagocytosis stimulating peptide［J］.Nature，1970，228（5272）：672-3.

［3］ Nishioka K.Anti-tumour effect of the physiological tetrapeptide，tuftsin［J］.Br JCancer，1979，39（3）：342-5.

［4］ 贾 娜.小鼠术后残瘤模型的建立及T肽抑制术后残瘤生长的初步研究［D］.北京：军事医学科学院，2010.

［4］ Jia N.Establishmentofpost-surgical residual tumormodeland primary research of TP inhibiting residual tumor growth.Beijing：Master′s degree thesis of Military Medical Science Academy of the PLA，2010.

［5］ 贺艳琳，顾若兰，韩 苏，等.一种人工合成Tuftsin类似肽大鼠组织分布和排泄研究［J］.解放军药学学报，2013，29：328-31.

［5］ He Y L，Gu R L，Han S，et al.Biodistribution and excretion of a synthetic tuftsin-analog in rats［J］.Pharm JChin People’s Liber Army，2013，29：328-31.

［6］ An Y，Li L，Yang D，et al.Anticancer activity of tuftsin-derived T peptide in postoperative residual tumors［J］.Anticancer Drugs，2014，25（8）：857-67.

［7］ 汪 琼，胡亚欧，贾 娜，等.促吞噬肽衍生物T肽对裸鼠术后残瘤VEGF表达的影响［J］.生物技术通讯，2012，23（6）：821-4.

［7］ Wang Q，Hu Y O，Jia N，etal.Effects of T peptide on VEGF expression of post-operative tumors in nudemice［J］.Lett Biotechnol，2012，23（6）：821-4.

［8］ 汪 琼，贾 娜，杨德宣，等.促吞噬肽衍生物T肽抑制小鼠移植瘤和术后残瘤生长的药效学研究［J］.军事医学，2012，36（5）：357-61.

［8］ Wang Q，Jia N，Yang D X，et al.Evaluation of inhibition effects of T peptide on postsurgical residual tumor growth［J］.MilitMed，2012，36（5）：357-61.

［9］ Mantovani A，Sozzani S，Locati M，et al.Macrophage polarization：tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes［J］.Trends Immunol，2002，23（11）：549-55.

［10］Mantovani A，Schioppa T，Porta C，et al.Role of tumor-associated macrophages in tumor progression and invasion.［J］.Cancer Metastasis Rev，2006，25（3）：315-22.

［11］赵 娟.巨噬细胞炎性蛋白-1α在多发性骨髓瘤发病机制中的作用［J］.国际输血及血液学杂志，2007，30（6）：540-2.

［11］Zhao J.Effect ofmacrophage inflammatory protein-1 alpha in the pathogenesis ofmultiple yeloma［J］.Foreign Med JBlood Transfus Heanatol，2007，30（6）：540-2.

［12］Hsu C J，Wu M H，Chen C Y，et al.AMP-activated protein kinase activation mediates CCL3-induced cellmigration and matrix metalloproteinase-2 expression in human chondrosarcoma［J］.Cell Commun Signal，2013，11（68）：.

［13］ Schoppmann SF1，Birner P，Stöckl J，et al.Tumor-associated macrophages express lymphatic endothelial growth factors and are related to peritumoral lymphangiogenesis［J］.Am J Pathol，2002，161（3）：947-56.

［14］汪 琼，免疫增强剂 T肽抗癌作用及机理研究［D］.北京：军事医学科学院，2012.

［14］Wang Q.Research of TPanti-cancer activity and mechanism［D］.Beijing：Doctoral Dissertation of Military Medical Science Academy of the PLA，2012.

［15］O′Reilly M S，Holmgren L，Shing Y，et al.Angiostatin：a novel angiogenesis inhibitor thatmediates the suppression ofmetastases by a Lewis lung carcinoma［J］.Cell，1994，79（2）：315-28.

［16］李 璘，邱蓉丽，乐 巍，等.肿瘤微环境中的非肿瘤细胞［J］.中国药理学通报，2012，28（4）：455.

［16］Li L，Qiu R L，LeW，etal.Non-tumor cells in tumormicroenviroment［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（4）：455.