LC-MS／MS法测定人血浆中羟基红花黄色素A的浓度

李长印，储继红，张 军，臧雨馨，戴国梁，邹建东，居文政

（1.南京中医药大学附属医院临床药理实验室，江苏南京 210029；2.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210002）

目前已报道的人血浆中QA含量的测定方法主要有 HPLC法［5-6］和 LC-MS／MS法［7］。HPLC法由于检测灵敏度较低，无法保证完全检测到低给药剂量下各个时点的人体QA血药浓度，从而保障药代动力学的顺利开展；同时由于检测波长下杂质干扰的影响，实现化合物的完全分离和准确定量往往采用梯度洗脱，因此需要更长的分析时间，不利于药代动力学研究中样品的批量分析。而LC-MS／MS法具有更高的检测灵敏度和更小的杂质信号干扰，因此更适用于测定人血浆中QA的浓度。但在已报道的LC-MS／MS方法中［7］，研究者采用 SPE方法对血浆样品进行前处理，在进样前必须进行吹干和复溶等操作，具有不利于高通量样品分析的缺点。同时，上述报道中LC-MS／MS方法的建立是为了研究单剂量口服QA制剂的药代动力学研究，因此线性范围偏窄，未进行稀释比实验等方面的考察。而开展系统的QA人体药动学研究一般涉及高、中、低3个剂量组的血药浓度测定，在保证低剂量组血药浓度检测灵敏度的前提下，高剂量组的血药浓度往往会超出定量上限，因此有必要进行稀释比实验等相关考察。基于此，本研究拟对已报道的测定方法进行系统优化，并对方法进行全面的方法学验证，以建立一种灵敏、简便、快速、可靠的QA人体血药浓度测定方法，用于人体药代动力学的系统研究。

1 材料

1.1 药品与试剂 羟基红花黄色素A（QA）对照品（中国食品药品检定研究院，批号111637-201106，含量92.5%，结构如Fig 1A所示）；异鼠李素-3-O-新橙皮苷（SLS）对照品（内标，中国食品药品检定研究院，批号111571-201205，含量93.2%，结构式见Fig 1B）；醋酸铵（Tedia Company Inc.，HPLC级，批号20266-0500）；甲醇（Merck Company，HPLC级）；超纯水由Millipore Milli-Q Advantage A10超纯水机制备；其余试剂为分析纯。注射用QA由广州悦康生物制药有限公司提供，25 mg／瓶，临用前用0.9%氯化钠注射液250 ml稀释，静脉滴注，输液泵流速4 ml／min。人空白血浆源自江苏省血液中心。

Fig 1 Chem ical structures of QA（A）and internal standard（SLS，B）

1.2 实验仪器 LC（Agilent）-（AB）API4000 MS／MS液质联用仪，含Pump Agilent 1260G1312A、Column Oven Agilent1260G1316A、Auto Sampler Agilent 1260G1367E和 Mass spectrometer API4000，LC-MS／MS系统由Analyst1.6 Software控制；CPA225D电子天平（德国Sartorius公司）；高速低温离心机（Thermo Sorvall Legend Micro 17R，PT021）；WH2微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；SPE小柱（waters Oasis＠HLB 3cc（60 mg）Extraction Cartridges）。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件 色谱条件：Agilent ZORBAX SB C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm），Agilent ZORAX SB-C8预柱（2.1×12.5 mm，5μm），流动相组成为 0.2 mol·L-1乙酸铵水溶液／甲醇（30／70），流速400μl／min，柱温35℃，分析 5 min，进样体积5μl。

质谱条件：ESI离子源，负离子模式检测，扫描方式为多反应检测（MRM），QA的检测目标离子对为 m／z 611.131／490.900，DP为 -125 V，CE为-34 eV，SLS的检测目标离子对为 m／z 623.032／298.800，DP为-150 V，CE为 -3462ev。其他主要质谱参数如下：Dwell Time 150 ms，ED-10V，CXP-11V，碰撞气（CAD）10，气帘气（CUR）25，辅助气 1（GS1）50，辅助气 2（GS2）55，电喷雾电压（IS）-4500，离子源温度（TEM）400。

2.2 标准溶液的配制

2.2.1 QA对照品储备溶液的配制 精密称取QA对照品11.31 mg（相当于含QA 10.46 mg）于10 ml容量瓶中，以甲醇溶解、定容，混匀即得浓度为1.046 g·L-1的QA标准曲线储备液，于4℃冰箱中保存备用。临用前用甲醇将其逐级稀释得到含QA浓度分别为 0.1714、0.3428、0.857、2.143、5.356、13.39、33.48、83.69 mg·L-1的系列标准曲线工作液。

精密称取QA对照品11.55 mg（相当于含QA 10.68 mg）于10 ml容量瓶中，以甲醇溶解、定容，混匀即得浓度为1.068 g·L-1的QA储备液，于4℃冰箱中保存备用。临用前用甲醇将其逐级稀释得到含 QA浓度分别为0.3297、2.968、71.23 mg·L-1的系列质控工作液。

2.2.2 内标SLS对照品储备溶液的配制 精确称取异鼠李素-3-O-新橙皮苷（SLS）对照品10.66 mg（相当于含SLS 9.935 mg）于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，得到浓度为0.9935 g·L-1的内标储备液；将此溶液稀释500倍，即得浓度为1.987 mg·L-1的内标工作液。储备液和工作液均于4℃冰箱中保存备用。

2.3 血浆样品处理

2.3.1 受试者含药血浆样品处理 取血浆400μl于1.5 ml EP管中，依次加入浓度为1.987 mg·L-1的内标工作液20μl、0.2 mol·L-1乙酸铵水溶液400μl，涡旋30 s混匀，12 000×g×5 min，4℃离心，吸取上清液750μl上样已活化的SPE固相小柱，上样完毕后用2 ml水洗除杂，最后用70%甲醇水1 ml洗脱，洗脱液涡旋混匀后进行LC-MS／MS分析。空白血浆样品除了未加内标之外，其余样品处理方法相同。

2.3.2 血浆标准曲线样品的配制与处理 取空白血浆400μl于1.5 ml EP管中，分别加入不同浓度的系列标准曲线工作液，涡旋混匀，即得含QA浓度分别为 8.570、17.14、42.85、107.1、267.8、669.6、1674、4185μg·L-1的系列血浆标准曲线样品，后续处理过程同“2.3.1受试者含药血浆样品处理”项下要求。

2.3.3 血浆质控样品的配制与处理 取空白血浆400μl于1.5 ml EP管中，分别加入不同浓度的系列质控工作液，涡旋混匀，即得含QA浓度分别为16.49、148.4和3561μg·L-1的系列血浆质控样品，后续处理过程同“2.3.1受试者含药血浆样品处理”项下要求。

2.4 分析方法的验证

Fig 2 Typical LC-MS／MS chromatograms of（A）blank human plasma；（B）QA spiked plasma sample（8．57μg·L-1）for LLOQ；（C）methanol solution of standard m ixture for QA（59．36μg·L-1）and IS（99．35μg·L-1）；（D）QA spiked plasma samp le（148．4μg·L-1）for quality control；（E）p lasma sample obtained from a volunteer at 5 h after drip intravenous infusion of QA injection containing 25 mg of QA

2.4.1 方法的特异性 Fig 2为6份不同来源人空白血浆、定量下限（LLOQ）血浆样品、标准品溶液、质控中浓度血浆样品和受试者静滴QA后血浆样品的特征色谱图。结果表明，在选定的LC-MS／MS条件下，血浆样品中QA和内标SLS的保留时间分别在2.7 min和3.9 min左右，空白血浆中的内源性物质和代谢物等不影响QA的准确测定。

2.4.2 介质效应 按“2.3.1血浆样品处理”项处理6种不同来源的空白血浆，获得其相应的空白血浆洗脱液。分别精密吸取QA低、中、高质控工作液各20μl，向其中分别依次加入内标工作液20μl、上述空白血浆洗脱液960μl，涡旋混匀，吸取5μl进样分析。每种来源的空白血浆均需配制低、中、高质控浓度样品，每个浓度平行3个样本。记录色谱图、QA峰面积As和内标峰面积Ai。计算6种不同来源血浆样品同一浓度的（n＝3）和所有浓度的

分别精密吸取QA低、中、高质控工作液各20 μl，向其中分别依次加入内标工作液20μl、甲醇960μl，涡旋混匀，吸取5μl进样分析。每个浓度平行3个样本。记录色谱图、QA峰面积As和内标峰面积Ai。计算同一浓度样品的（n＝3）和所有样品的

按下列公式计算介质效应：QA的介质效应ME100%，内标SLS的介质效应MEi×100%。QA低、中、高3个浓度血浆质控样本的平均介质效应分别为116.62%、119.06%和115.72%，RSD分别为3.27%、3.42%和4.93%，内标平均介质为78.97%，RSD分别为1.53%。结果表明，该方法中QA及内标的介质效应精密且可重现。

2.4.3 标准曲线线性、稀释比考察和定量下限 按照“2.3.2血浆标准曲线样品的配制与处理”项配制处理并测定血浆标准曲线样品，记录色谱图、QA峰面积As和内标峰面积Ai。以QA血药浓度C为X轴，以 As与 Ai的峰面积比值 f（f＝As／Ai）为 Y轴进行权重回归（权重系数为1／C2），得标准曲线回归方程为Y＝（0.0124±0.0017）X+（0.0269±0.0051）（n＝9），相关系数r在0.9949～0.9992之间。结果表明：血浆中QA浓度在8.570～4185μg·L-1范围内，浓度与峰面积的比值线性关系良好。同时，稀释比试验结果表明，浓度超出定量上限6.25倍（即26 150μg·L-1）以下的QA血浆样品经空白血浆稀释6.25倍后，实测浓度的准确度为88.03%～90.97%，RSD为1.73% ～5.09%，即通过稀释可以实现高浓度血浆样品药物浓度的准确测定。

按照“2.3.2血浆标准曲线样品的配制与处理”项平行配制处理5份血浆标准曲线最低点样品并进行测定。记录色谱图、QA峰面积As和内标峰面积Ai。计算 As和 Ai的比值 y（y＝As／Ai），将 f值代入随行标准曲线求得实测浓度，进而计算其准确度和RSD（n＝5）。LLOQ典型色谱图见 Fig 2。结果表明：本方法中QA的LLOQ为8.570μg·L-1，实测浓度的准确度为97.59%，RSD为4.45%。

2.4.4 精密度和准确度考察 按“2.3.3血浆质控样本的配制和处理”项配制处理并测定QA低、中、高3种浓度的血浆质控样本，每个浓度制备5个样本，连续制备并测定3批。记录色谱图、QA峰面积As和内标峰面积Ai。计算As和Ai的比值 f（f＝As／Ai），将f值代入随行标准曲线求得实测浓度及其准确度。批内和批间精密度分别用批内（n＝5）和3批间（n＝15）的浓度实测值的RSD值表示。考察结果如Tab 1所示，结果表明，该方法的批内和批间精密度和准确度良好。

2.4.5 提取回收率考察 按“2.3.3血浆质控样本的配制和处理”项配制处理并测定QA低、中、高3种浓度的血浆质控样本，每个浓度平行3个样本。记录色谱图、QA峰面积（As）B和内标峰面积（Ai）B。按“2.3.1血浆样品的处理”项处理获得空白血浆洗脱液若干，用于配制未经提取含药血浆样品。分别精密吸取QA低、中、高质控工作液各20μl，向其中分别依次加入内标工作液20μl、空白血浆洗脱液960μl，涡旋混匀，吸取5μl进样分析。每个浓度平行3个样本。记录色谱图、QA峰面积As和内标峰面积Ai。计算同一浓度样品的和所有样品的按下列公式计算提取回收率：QA的提取回收率×100% ×（840／750），内标 SLS的提取回收率 RECi＝（Ai）B／×100% ×（840／750）。QA低、中、高 3个浓度血浆质控样本的平均提取回收率分别为77.75%、80.90%和80.76%，RSD分别为1.70%、1.78%和4.15%，内标平均提取回收率为104.57%，RSD分别为5.47%。结果表明，该方法中QA和内标的提取回收率精密且可重现。

Tab 1 Intra-and inter-batch precision and accuracy for determ ination of QA in human p lasma

Tab 2 Short-term，freeze-thaw，long-term and post-preparative stability of QA in human p lasma（n＝3）

2.4.6 稳定性考察 按“2.3.3血浆质控样本的配制和处理”项配制QA低、中、高3种浓度的血浆质控样本，分别考察血浆样本室温放置4 h、-70℃冰箱中保存并反复冻融3次、-70℃冰箱保存1个月及样品处理后自动进样器（8℃）中放置24 h的稳定性。考察结果详见Tab 2，结果表明，在上述各种条件下样品的稳定性良好。

2.5 应用 36名健康男性受试者，经体检合格，签署知情同意书，并经南京中医药大学附属医院伦理委员会审批同意，均分为低、中、高3个剂量组进行药代动力学实验。3组分别单次静滴剂量为25、50和75 mg的注射用QA后，于静滴前、静滴开始后20、40 min和拔针后 0、10、30、45 min、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、23 h由肘静脉取血3 ml，置肝素化采血管中，混匀，离心（4 000 r·min-1，4℃，5 min），分离上层血浆，按“2.3.1受试者含药血浆样品处理”项下操作，进样分析测定各血浆样品中QA的浓度。测定结果显示，低、中、高3个剂量组的QA血药浓度范围分别为（10.71～2368）、（11.59～4086）、（28.6～4489）μg·L-1。上述结果表明，所建立的QA血药浓度LC-MS／MS分析测定方法适用于QA人体药代动力学的系统研究。

3 讨论

3．1 分析方法的优化 在方法学建立过程中，我们对色谱柱、流动相组成、样品前处理和内标选择进行了系统全面的优化。结果表明：①Agilent ZORBAX SB C18色谱柱分离效果和峰形优于Thermo syncronis C8柱；② 流动相中加入浓度为0.2 mmol·L-1乙酸铵可提高QA的色谱峰响应强度，而在样品处理过程中，加入0.2 mol·L-1乙酸铵则可以使QA和内标的柱保留时间保持稳定；③ 采用固相萃取（SPE）法处理血浆时，QA的提取回收率明显高于液液萃取法和有机溶剂沉淀法，waters Oasis＠HLB小柱提取效果优于Thermo Soly小柱；④QA血浆样品分析过程中易出现色谱峰前延现象，在流动相中和SPE处理上样前的样品中同时加入乙酸铵可改善峰前延问题，但浓度增高会降低QA和内标的质谱响应，故最终优化确定其浓度为0.2 mmol·L-1和0.2 mol·L-1；⑤ 作为定量用内标，SLS和葛根素在本研究的分析条件下色谱峰峰形良好，而芦丁色谱峰有拖尾现象出现；多次反复进样发现，SLS的响应强度稳定，而葛根素的响应值有增大趋势，因此最终选择SLS作为本方法的内标。

3.2 分析方法的改进 与先前报道的QA血浆浓度测定的 LC-MS／MS方法［7］相比，本方法的改进之处在于：① 通过对高浓度QA血样进行稀释比考察，扩大了分析方法可以准确定量的浓度范围。本方法的最终可准确定量范围为8.570～26 150μg·L-1，远高于先前报道的1 000倍浓度跨度。②得益于方法学建立过程的系统优化，检测的灵敏度有所提高，从而减少了血浆样品用量，即从先前报道的1 ml减少至400μl。③ 简化了样品SPE处理过程，洗脱液即可直接进样分析，无需进行吹干、复溶等繁杂操作。上述改进使得本方法能够对低、中、高不同剂量组受试者的QA血药浓度实现简单快速、灵敏准确的测定，从而保证系统的QA人体药代动力学研究的顺利开展。

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