载顺铂聚乳酸静电纺丝膜对口腔鳞癌细胞的杀伤作用研究

周丽佳，杨 洲，张士博，郝秀峰＊，张泽兵＊

载顺铂聚乳酸静电纺丝膜对口腔鳞癌细胞的杀伤作用研究

周丽佳1，杨 洲2，张士博1，郝秀峰2＊，张泽兵1＊

（1．吉林大学口腔医院，吉林长春130021；2．吉林大学化学院，吉林长春130012）

目的 探讨载顺铂聚乳酸静电纺丝膜对口腔鳞癌CAL－27细胞的杀伤作用。方法 利用静电纺丝技术将顺铂（DDP）、聚乳酸（PLA）混合溶液制成载顺铂聚乳酸静电纺丝膜（DDP／PLA膜）。通过扫描电镜（SEM）观察DDP／PLA膜表观形态，紫外分光光度分析法测定PLA膜的降解速率，MTT法观察细胞的增殖活性。实验分为空白对照组，DDP组，PLA膜组，DDP／PLA膜组。结果 SEM可以观察到纳米纤维表面光滑、直径均匀；降解速率显示聚乳酸静电纺丝膜在第一天降解50%左右，以后降解缓慢，在第13天降解趋于完毕；细胞增殖活性结果显示：不含药物的纯膜对细胞基本无影响，不具有统计学意义（P＞0．05）；DDP组、DDP／PLA组抑制细胞增殖活性，有统计学差异（P＜0．05）；实验前3天DDP组作用效果好于DDP／PLA膜组，3天后DDP／PLA膜组作用效果优于DDP组，与DDP组相比，相同剂量的DDP／PLA组对细胞的杀伤作用时间延长。结论 DDP／PLA膜可以杀伤口腔鳞癌CAL－27细胞，3天后的作用效果优于DDP组；DDP／PLA膜具有缓释作用，作用时间较DDP组长。

静电纺丝；聚乳酸；顺铂；CAL－27细胞

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0179）

口腔癌是第6大常见肿瘤，5年生存率约为60%［1］。化疗是口腔癌治疗的常用方法，但口腔癌的整体化疗效果不佳，晚期的效果更差［2］。多数的化疗药物在体内有吸收不规则、半衰期短、毒副作用明显等缺点［3］。通过改善化疗药物的给药途径，可达到增效减毒的作用，为此，我们将生物相容性和降解性良好的聚乳酸（PLA）与化疗药物顺铂混合一起，制备成载顺铂聚乳酸静电纺丝膜，观察其对口腔癌细胞的杀伤作用，从而达到局部化疗、持续给药、降低全身毒副反应的目的。

1 材料与方法

1．1 细胞﹑主要试剂及仪器

采用高压静电纺丝技术制备DDP／PLA纳米纤维药膜，高压静电直流电源（东文高压电源（天津）有限公司，型号：DW－P303－1ACF0），注射泵（保定申辰泵业有限公司，型号：SPLab02）。扫描电镜（型号：SU8020，厂家：HITACHI）。口腔癌CAL－27细胞为上海九院陈万涛教授惠赠，培养液为含有10%小牛血清的RPMI－1640（含100U·ml－1青霉素和含100mg·L－1的链霉素）。DDP购置于齐鲁有限公司。用培养液配置成100mg·L－1储备液，于－20℃下保存，使用前稀释成所需浓度。噻唑蓝（MTT，Sigma公司）。

1．2 SEM观察纳米纤维膜形貌将PLA膜、DDP／PLA膜分别裁剪成5mm×5mm大小送检观测，电压10kV。

1．3 紫外分光光度计测定PLA膜降解速率

本实验采用PLA包裹白蛋白（BSA）检测聚乳酸的降解速率，了解药物的体外释放情况。先通过设置已知系列浓度的BSA标准品，由紫外分光光度计测出白蛋白浓度的标准曲线，再由微量电子天平精确称取BSA／PLA膜100mg，其中含有BSA 32．5mg。将样品浸泡于装有100ml的PBS（pH＝7．4）缓冲液的小烧杯中，符合漏槽条件，密封后再将此烧杯放于（37℃）的水平恒温振荡器内进行动态透析，分别于10min、30min、1h、2h、3h、4h、8h、24 h、3d、4d、5d、7d取释放液10ml，取样至释放完全，并迅速补充空白PBS缓冲液10ml，维持原体积不变。用紫外－可见光分光光度计于波长280nm处测定所取透析液的吸光度，根据标准吸收曲线计算不同时间载BSA／PLA膜释放的量，再计算累计释放量并绘制体外释放曲线。

1．4 细胞培养

口腔癌CAL－27细胞在含有10%小牛血清的中RPMI－1640培养液（含100U·ml－1青霉素和含100mg·L－1的链霉素），于37℃﹑5%CO2饱和湿度的孵箱中培养。每2d换液传代1次，使其保持对数生长状态，取对数生长期细胞进行实验。

1．5 MTT法检测空白膜的生物毒性

实验分为对照组﹑PLA膜组。对照组加入200μl的培养液；PLA膜组加入PLA膜。取对数生长期的CAL－27细胞，按每孔1×104个细胞接种于96孔细胞培养板，每孔加入200μl细胞悬液，培养24h后弃去上清液，按照设置的3组每孔加入200μl溶液，每组设3个复孔，置37℃、5%CO2孵箱中，培养12h后每孔加入20μl MTT（5mg· L－1）溶液，培养4h。弃上清，每孔加入150μl DMSO，室温下恒温水浴箱内振荡10min，于酶标仪检测各孔在波长490nm处的A值，计算细胞生存率。

1．6 MTT法检测加入DDP药和DDP／PLA膜后细胞增殖活性

实验分为对照组﹑DDP药组﹑DDP／PLA膜组。对照组加入200μl的培养液；DDP药组加入浓度为5mg·L－1的DDP溶液；DDP／PLA膜组加入含有1μg药量的DDP／PLA膜。取对数生长期的CAL－27细胞，按每孔6×103个细胞接种于96孔细胞培养板，每孔加入200μl细胞悬液，培养24h后弃去上清液，按照设置的3组每孔加入200μl溶液，每组设3个复孔，置37℃﹑5%CO2孵箱中，培养12h后每孔加入20μl MTT（5mg·L－1）溶液，培养4h。弃上清，每孔加入150μl DMSO，室温下恒温水浴箱内振荡10min，于酶标仪检测各孔在波长490nm处的A值，计算细胞生存率。细胞生存率＝实验组A值／对照组A值×100%。

1．7 统计学分析

采用SPSS17．0软件进行统计分析，组内比较采用t检验，细胞生存率以百分率表示。

2 结果

2．1 PLA膜及DDP／PLA膜的形态学表现

通过SEM观察PLA膜（图1a）及DDP／PLA膜（图1b）中纳米纤维形貌，可见纳米纤维连续，表面光滑，无结晶，直径较均匀。

2．2 体外释放测定聚乳酸降解速度

药膜在PBS溶液中释放均匀缓慢（图2）。在本实验中，第24h时BSA累积释放量约为50%，以后逐渐缓慢释放，第13d时BSA累积释放量约为94%。根据图中累积释放曲线可以看出BSA的释放量随着时间的延长而增加。BSA的累积释放量与时间呈依赖关系。

2．3 MTT法验证空白膜毒性

空白膜组细胞生存率为98．9%，与对照组相比，无明显差别，P＝0．879（P＜0．05），其生存率如图3。

2．4 MTT法检测加入DDP药和DDP／PLA膜后细胞增殖活性

DDP／PLA组、DDP组对细胞生存率的影响如图4所示。第1天，DDP／PLA组的细胞生存率与对照组相比无明显变化，而DDP组的细胞生存率低于对照组，P＝0．043（P＜0．05），有统计学差异；第2天，DDP／PLA组细胞生存率开始下降，与对照组相比P＝0．033（P＜0．05），有统计学差异，但细胞生存率仍高于DDP组；第3－7天，DDP／PLA组的细胞生存率均低于DDP组，且两组间P＜0．01。

图1 a．扫描电镜观察纯PLA膜中纳米纤维形图1b．扫描电镜观察DDP／PLA膜中纳米纤维形貌

图2 BSA／PLA累积释放率曲线。

图3 对照组和空白膜组细胞生存率比较

图4 DDP／PLA膜组与DDP药组细胞生存率的变化

3 讨论

由于纳米材料在药物转运系统中的特点，已经被广泛研究，目前已有多种形式，如纳米微球、脂质体、碳纳米管、静电纺丝等。静电纺丝技术是目前制备超细纤维最重要的方法之一，已在生物医学领域用来制作药物传输与缓控释放的载体及创伤敷料等［4］，静电纺丝的最重要医疗应用之一是用作药物控释载体。虽然在此方面的研究有限，它已经吸引了越来越多的关注［5］．聚乳酸（PLA）的生物相容及可降解性良好，作为人工合成医用高分子的典型代表，已在临床上获得广泛应用［6］。控制纤维表面空隙的形状及尺寸使纤维具有许多潜在应用，如催化反应，过滤，吸收，太阳能电池，燃料电池，电池等，然而，在医学领域中，在组织工程和药物转运中纤维的使用也变得越来越显著［7］。与其他药物制剂相比，载药静电纺丝纤维具有较高的药物包封率和更好的稳定性吸引了极大的关注，由于其表面积与体积比高，使其具有很好的药物疗效［8］；同时在药物转运方面具有很多优点，尤其对特定区域或者低剂量形式的感染和抗癌药物的转运［9］。Antoniya Toncheva等用L－丙交脂－co－D（coPLA）和coPLA／聚乙二醇（PEG）制作载有氟喹诺酮诺酮类（盐酸环丙沙星，左氧氟沙星半水合物（左旋）或莫西沙星盐酸盐（莫西））的静电纺丝，通过红外光谱及荧光显微镜证实抗生素已被载入到纤维中。结果发现，抗生素的释放速率与抗生素自身特性无关，而与载抗生素的纤维复合物有关。在聚乙二醇的存在下，在最初的两个小时药物释放加快，通过金黄色葡萄球菌微生物实验证实coPLA／环丙沙星，coPLA／PEG／环丙沙星，coPLA／左旋，coPLA／PEG／左旋，coPLA／莫西，coPLA／PEG／莫西静电纺丝纤维抑制细菌生长。并且静电纺丝纤维内抗生素的存在使细菌粘附力大大降低［10］。Zheng等用纳米羟基磷灰石（n－HA）作为载体包裹阿霉素制备成载有阿霉素的纳米羟基磷灰石颗粒，然后将载有载有阿霉素的纳米羟基磷灰石颗粒混入聚乳酸－羟基乙酸中溶解，并制备成载阿霉素羟基磷灰石颗粒的聚乳酸羟基乙酸静电纺丝。结果显示，制备的载阿霉素羟基磷灰石的聚乳酸－羟基乙酸静电纺丝具有均匀而连续的纤维形态。有效减小了突释效果，从纳米纤维中释放的阿霉素对KB细胞的生长具有抑制作用［11］。Liu等将聚乙二醇－左旋聚乳酸静电纺丝作为大环内酯类抗生素布雷菲德菌素A（BFA）的控释系统，通过MTT法检测其对HepG2的杀伤作用。结果表明，载有BFA的聚乙二醇－左旋聚乳酸静电纤维对BFA具有控释效果并适用于术后癌症的化疗［12］。口腔癌病变位置表浅，可以采用间质化疗的方式将静电纺丝膜植入病变部位，能显著增加手术区域药物浓度，而血浆中药物浓度无明显增加；在降低患者全身毒副反应的同时，有效的提高患者术后生存率，降低复发及转移的可能性［13］。

本研究结果显示，PLA纳米纤维表面光滑，直径较均匀。药物24h释放约50%，出现突释，而后释放缓慢，在第13天药物累积释放率约为94%，说明PLA降解趋于完全。DDP／PLA膜与DDP药对口腔鳞癌CAL－27细胞株的体外杀伤实验表明，二者都具有时间依赖性，DDP药的杀伤效应时间主要在1－3d，此后逐渐进入平台期，即3天时DDP药的杀伤作用已达到最大；而DDP／PLA组在48h之内，由于药物累计释放率不足，所以细胞杀伤作用明显低于DDP药；但48h之后，随着药物的不断释放，其细胞杀伤作用逐渐高于DDP药。这一结果表明，作为一种缓释剂，随着时间的延长，顺铂不断从静电纺丝中释放并维持在较高浓度，从而延长了顺铂的有效作用。顺铂在具有抗癌作用的同时，它对机体的消化系统、骨髓、肾脏以及内耳等产生毒性损伤，其中以对肾脏及内耳的毒副作用最为严重。由于顺铂是以浓度决定疗效的抗肿瘤药物，短时间内所给药物浓度越高，疗效也就越好，而大剂量使用顺铂无疑会增加其副作用［14］；并且由于其半衰期短，在体内不断被分解代谢，很难维持其有效的浓度。本研究结果表明，DDP／PLA膜具有缓释作用，可以在较长时间内维持药物浓度，保持对肿瘤细胞的杀伤作用，降低毒副作用，延长化疗药物的作用时间。综上所述，DDP／PLA膜具有较好的优越性，能提高局部药物浓度，为口腔癌的化疗提供了一个新的思路，具有很好的临床应用价值。

［1］David E，Hui Z，Jean R，et al．Prevalidation of Salivary Biomarkers for Oral Cancer Detecion［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2012，21：664．

［2］曹雨庵，郭 伟．我国口腔鳞癌的治疗现状［J］．实用肿瘤杂志，2012，27（2）：109．

［3］玄云泽，张建国，张杰，等．靶向持续性组织间化疗治疗舌鳞癌的初步观察［J］．实用口腔医学杂志，2006，22（2）：148．

［4］Chen Y，Lin J，Fei Y，et al．Preparation and characterization of eletrospinning PLA／curcumin composite membranes［J］．Fiber and Polymers，2010，11（8）：1128．

［5］Zeng J，Yang L X，Liang Q Z，et al．Influence of the drug compatibility with polymer solution on the release kinetics of electrospun fiber formulation［J］．Journal of Controlled Release，2005，105（1－2）：43．

［6］王华林，丁 曼，翟林峰，等．壳聚糖／聚乳酸复合纳米纤维的制备与表征［J］．高分子材料科学与工程，2013，29（1）：162．

［7］Touny AH，Bhaduri SB．A reactive electrospinning approach for nanoporous PLA／monetite nanocomposite fibers［J］．Mater．Sci．Eng．C，2010，30（8）：1304．

［8］Kenawy ER，Abdel－Hay F I，El－Newehy M H，et al．Processing of polymer nanofibers through electrospinning as drug delivery systems［J］．Mater Chem Phys，2009，113（1）：296．

［9］Roya S，Mohammad I．Stimuli－responsive nanofibers prepared from poly（N－isopropylacrylamide－acrylamide－vinylpyrrolidone）by electrospinning as an anticancer drug delivery［J］．Designed Monomers and Polymers，2013，16（6）：515．

［10］Antoniya T，Dilyana P，Vera M，et al．Antibacterial fluoroquinolone antibiotic－containing fibrous materials from poly（L－lactideco－D，L－lactide）prepared by electrospinning［J］．European Journal of Phamaceutical Sciences，2012，47（4）：642．

［11］Zheng FY，Wang SG，Shen MW，et al．Antitumor efficacy of doxorubicin－loaded electrospunnano－hydroxyapatite－poly（lacticco－glycolic acid）composite nanofibers［J］．Polym Chen，2013，4：933．

［12］Liu WY，Wei JC，Huo P，et al．Controlled release of brefeldin A from electrospun PEG－PLLA nanofibers and their in vitro antitumor activity against HepG2cells［J］．Mater Sci Eng C，2013，33（5）：2513．

［13］汪维健，匡 威，李洪涛，等．缓释型氟尿嘧啶局部植入治疗口腔癌的初步研究［J］．中国现代药物应用，2012，6（6）：11．

［14］廖英俊．抗癌药顺铂毒性作用及多种药物联合拮抗其毒性的研究［D］．中国医科大学博士学位论文．2005．

Polylactic acid containing cisplatin electrostatic spinning membrane for cytotoxicity study of oral squamous cell carcinoma cell in vitro

ZHOU Li－jia1，YANG Zhou2，ZHANG Shi－bo1，et al．
（1．Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun130021，China；2．School of Chemistry，Jilin University，Changchun130012，China）

Objective To investigate cisplatin containing polylactic acid electrospun membranes for cytotoxicity study oral cancer CAL－27cells in vitro．Methods Making cisplatin（DDP）and PLA mix together to fabricate polylactic acid containing cisplatin nanofibers（DDP／PLA）membrane by electrospinning method．The micro morphology was observed by scanning electron microscope（SEM），the degradation rate of PLA membrane by UV spectrophotometric，the proliferation activity of CAL－27cells was observed by tetrazolium bromide（MTT）colorimetry，The CAL－27cells were divided into conntrol group，DDP group，PLA membrane group，DDP／PLA membrane group．Results Nanofibers was smooth and uniform diameter through SEM；On the first day，the degradation rate of PLA membrane was about 50%，after the degradation rate was slow and degradation tends to completely In the thirteenth day．The MTT result showed that the cell proliferation in PLA membrane group was no significant impact（P＜0．05），DDP group and DDP／PLA group could inhibit cell proliferation，which was statistic significance（P＜0．05）．Three days of beginning of the experiment，the effect of cell killing treat with DDP was better than DDP／PLA group．three days later，the effect of cell killing treat with DDP membrane was better than DDP group．Campared with the DDP group，the same dose of DDP／PLA group on cell killing effect was longer．Conclusion DDP／PLA membrane could kill cells in oral squamous cell carcinoma CAL－27，three days later，the effect of cell killing treat with DDP membrane was better than DDP group；DDP／PLA nanofibers membrane owns good controlled release effect and has better effect than DDP group．

Electrospinning；PLA；DDP；CAL－27

R730．53

A

周丽佳（1989－），女，黑龙江省绥化市人，医学硕士，主要从事口腔肿瘤病理学的研究。

2013－08－15）

1007－4287（2014）02－0179－04

吉林省科技发展计划项目（201105101）

＊通讯作者