三种单基因遗传病的产前分子诊断

徐盈 张建芳郭芬芬 黎昱 燕凤 徐慧 任菊霞 宋婷婷王德堂 辛晓燕 陈必良

（第四军医大学西京医院妇产科，陕西西安 710032）

三种单基因遗传病的产前分子诊断

徐盈 张建芳*郭芬芬 黎昱 燕凤 徐慧 任菊霞 宋婷婷王德堂 辛晓燕 陈必良

（第四军医大学西京医院妇产科，陕西西安 710032）

目的探讨脊髓性肌萎缩症（SMA）、苯丙酮尿症（PKU）和先天性软骨发育不全（ACH）产前基因诊断的高效的临床检测方法。方法根据不同单基因病的基因突变类型，本研究应用DHPLC技术对1例SMA阳性家族史的胎儿绒毛样本进行SMN1基因7号外显子缺失检测，选择正常人及SMA患者作对照。通过直接测序法分别对PKU家系和ACH家系的患者、表型正常的个体及其胎儿进行PAH致病基因和FGFR3基因第10外显子进行检测。结果SMA阳性家系中，胎儿未检测到SMN1基因7号外显子的纯合缺失，建议继续妊娠，结果顺利产出1名正常儿。PKU阳性家系通过检测发现患者在PAH基因上确实存在无义突变，c.781C＞T（p.Arg261Ter）和错义突变c.842C＞T（p.Pro281Leu），均为杂合子。但是胎儿与患者母亲的突变类型一致，为携带者，不发病，建议继续妊娠。软骨发育不全患者送检标本FGFR3基因外显子10发现1处序列异常，为c.1138G＞A，导致编码氨基酸改变Gly380Arg，但其胎儿羊水标本检测FGFR3基因外显子10未发现序列异常。结论根据单基因病不同的基因突变类型，选择合适的方法可快速、准确地实现单基因病产前基因的诊断，尽早避免单基因病患儿的出生。

单基因病；产前分子诊断；脊髓性肌萎缩症；苯丙酮尿症；先天性软骨发育不全

目前，遗传病与心血管病、癌症一起成为严重危害人类健康和致死率最高的前三名疾病，也是我国出生缺陷的重要原因之一［1］。其中单基因病是遗传病中最主要的一个类型，它是指由于单个基因异常导致且以孟德尔方式遗传的疾病。根据WHO统计显示［2］，全球出生人口单基因病累计发病率高达10／1000。尽管单个单基因疾病非常罕见，但所有单基因病累计占婴儿死亡率约为20%，儿科住院率达10%。脊髓性肌萎缩症（SMA）、苯丙酮尿症（PKU）和先天性软骨发育不全（ACH）是高发率、高致畸率的遗传病，这些单基因遗传病不仅影响着患儿及其后代的生存质量，而且已经成为影响人们正常生活的社会问题，进行这些单基因遗传病的产前诊断是防止患儿出生的强有力的手段。

单基因病的检测方法很多，产前基因诊断存在高风险性、时间紧迫性等缺点，因此准确、高效的一线检测手段迫切需要。导致单基因病发生的主要原因有基因的缺失、重复、点突变等，因此，在临床检测中需要根据不同单基因病的基因突变类型，建立可靠高效的方法。通过文献检索发现［3-5］，SMN1第7、8号外显子在98.6%的SMA患者中有纯合缺失或截断，是儿童型SMA发病的主要原因；而PAH基因的突变是导致苯丙酮尿症（PKU）发生的主要致病基因；先天性软骨发育不全的致病基因FGFR3存在一个突变热区是FGFR3基因第10号外显子的1138位核苷酸。根据这3种不同的基因突变类型，本研究分别应用DHPLC技术和直接测序法对具有脊髓性肌萎缩症、苯丙酮尿症和先天性软骨发育不全患者家庭中孕妇绒毛或者羊水样本进行产前分子诊断，以期达到避免SMA、PKU和ACH患儿出生的目的。

1 材料与方法

1.1 基本资料

1.1.1 孕10周，第二胎，已育1男孩，8月时表现为四肢肌力，肌张力较差，不能活动，勉强可以坐。

1.1.2 孕21周，第二胎，已育1男孩，临床诊断为苯丙酮尿症。

1.1.3 孕18周，第一胎，孕妇为软骨发育不全患者。

1.2 方法

1.2.1 样本的采集 外周血采集：用一次性无菌注射器取受试者静脉血4 ml，于紫色收集管（EDTA抗凝）内，4℃保存备用。胎儿样本的采集：孕妇排空膀胱，平卧位，无菌消毒条件下，在B超定位下经腹部行绒毛或者羊水穿刺术，采集胎儿样本。

1.2.2 DNA提取 采用天根公司全血DNA提取试剂盒提取绒毛、羊水和外周血DNA，采用分光光度计和0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA浓度检测，－20℃保存备用。

1.2.3 基因检测方法

1.2.3.1 脊髓性肌萎缩症的基因检测［6］PCR反应液体系：2μl d NTP（0.25 m M），1μl引物（F-R）（10p），0.5μl Mg（0.25 m M），0.18μl Qiagen热启动Taq E（5U／μl），1μlDNA模板，其余用dd H2O补足到5μl。正向引物SMN1 F：5′-TGTCTTGTGAAACAAAATGCT-3′；反向引物SMN1 R：5′-AAAAGTCTGCTGGTCTGCCTA-3′。

SMN1基因外显子7缺失筛查PCR反应程序：预变性95℃10分钟；变性95℃15秒；退火60℃60秒，延伸60℃60秒（循环40次）；最后延伸60℃10分钟。PCR扩增产物检测后，以正常个体的样本为参照，取PCR产物5μl，先采用美国环球基因公司DHPLC分析仪对SMN1基因外显子7缺失筛查，分析柱温度为54℃，片段长度426bp，自动加样，洗脱，检测SMN1外显子缺失和基因拷贝数检测。DHPLC峰值可通过WAVE MAKER软件自动测量每个外显子产物峰的高度。计算公式［（样本组求出检测峰／参照峰）÷（正常对照组求出检测峰／参照）］校正后比值后约等于1.0，则检测的基因外显子正常（双拷贝）；如得到的数值约等于0.5，则显示检测的基因外显子存在杂合性缺失；如得到的数值大于2.0，则显示检测的基因外显子拷贝数存在异常重复。

1.2.3.2 苯丙酮尿症检测［7］设计苯丙酮尿症的致病基因PAH基因的外显子及其侧翼序列的引物，PAH基因检测PCR反应程序：预变性95℃5分钟；变性95℃35秒；退火56℃35秒，延伸72℃35秒（循环29次）；最后延伸72℃10分钟。PCR扩增产物送上海生工直接测序。

1.2.3.3 先天性软骨发育不全的检测过程 FGFR3基因外显子10引物序列参考文献［8］，由上海生工公司合成，PCR反应程序：预变性95℃5分钟；变性95℃30秒；退火61℃30秒，延伸72℃30秒（循环32次）；最后延伸72℃10分钟。

2 结 果

经DHPLC技术检测结果发现患者SMN1基因exon7纯合缺失，拷贝数为0，其父母亲均为SMA致病基因携带者，SMN1基因的exon7拷贝数为1，可推测出患者的致病基因分别遗传自父亲和母亲。明确突变位点后，对胎儿绒毛组织进行检测，STR遗传位点分析显示无母体细胞污染。胎儿的SMN1基因第7外显子未见缺失，拷贝数为2，根据SMN基因缺失频率分析表明胎儿90%以上是正常儿，建议其继续妊娠，胎儿已经出生，发育正常，取外周血重复诊断，结果与产前诊断结果一致（图1）。

图1 脊髓性肌萎缩症家系产前基因诊断

对苯丙酮尿症家系进行PAH基因测序显示：先证者在PAH基因上存在无义突变c.781C＞T（p.Arg261Ter）和错义突变c.842C＞T（p.Pro281Leu），均为杂合子。先证者父亲在PAH基因上存在无义突变c.781C＞T（p.Arg261Ter），为杂合子；不存在错义突变c.842C＞T（p. Pro281Leu）。先证者母亲在PAH基因上不存在无义突变c.781C＞T（p.Arg261Ter）；存在错义突变c.842C＞T（p.Pro281Leu），为杂合子。推测出患者的两个突变分别来自父亲和母亲，为复合杂合突变类型，经相关文献检测发现该复合杂合突变类型可能是导致患者发病的原因。对胎儿羊水细胞检测显示：胎儿羊水样本在PAH基因上不存在无义突变c.781C＞T（p.Arg261Ter）；存在错义突变c.842C＞T（p.Pro281Leu），为杂合子，与患者母亲的突变类型一致，可以推测胎儿为携带者，不发病，可以继续妊娠（图2）。

图2 苯丙酮尿症家系产前基因诊断测序图

软骨发育不全患者经基因测序：患者在FGFR3基因外显子10发现1处序列异常，c.1138G＞A，导致编码氨基酸改变Gly380Arg。检测结果在人类基因突变数据库进行检索分析，c.1138G＞A（Gly380Arg）改变与软骨发育不全密切相关。胎儿羊水样本在FGFR3基因外显子10未发现序列异常，STR遗传位点分析显示无母体细胞污染，其遗传方式符合孟德尔遗传定律（图3）。建议其继续妊娠，胎儿已出生，发育正常。

3 讨 论

单基因病具有亲代向子代遗传传递的特性，患者一旦被诊断为遗传性疾病，对家庭的打击是巨大的，患者及其亲属常常难以接受和承认患病的事实，该类遗传病只有通过产前诊断才能有效防止患儿出生。产前分子诊断主要针对有生育患儿风险夫妇的胎儿进行诊断，通过分子诊断可对明确诊断为某种疾病的胎儿采取干预措施，如对目前尚无治愈可能的单基因病的胎儿可建议实施选择性流产［9］。目前国内外已实现多种取材方法（绒毛、羊水、脐血、母体外周血富集胎儿有核细胞）和多种分子学检测手段（PCR-RFLP、PCR单链构象多态性、DNA测序、高效液相色谱等）结合，对单基因病进行产前基因诊断。基因检测是单基因病产前诊断的金标准，避免了产前超声容易造成的误诊和不必要的治疗性引产。

Migita等［10］认为早期绒毛膜细胞易被母体组织细胞污染，在SMA家系产前诊断研究中，我们采用经腹绒毛活检术，获取胎儿绒毛膜细胞进行SMN1基因第7号外显子的DHPLC方法检测，同时以STR遗传位点判断是否存在母体细胞污染，可在早期进行取材，安全性较高，结果准确［11］。绒毛活检在单基因病中具有重要的临床价值，单基因病家庭可在孕早期选择合适妊娠方式，若胎儿未检测出突变位点，建议继续妊娠，减轻家庭的心理负担。若胎儿检测出突变位点，且该单基因病无法治疗，可建议其终止妊娠。若胎儿为携带者，建议其后代也应进行产前分子诊断，有效地避免患儿的出生。因此，妊娠早期采集绒毛进行单基因病的分子学诊断可以达到早诊断、早发现、早干预的目的。

图3 软骨发育不全家系产前基因诊断测序图

此外，羊膜腔穿刺已成为当今世界最常用且安全可靠的产前诊断取材方法，本研究中我们分别对PKU家系孕18周和ACH家系孕24周羊水细胞进行直接测序法检测。在PKU家系中，患者在其PAH基因编码区发现1个无义突变c.781C＞T（p.Arg261Ter），为杂合子，该突变造成PAH氨基酸编码提前终止，很可能影响其蛋白功能。已有该位点致病性的相关报道，且其在人群中发生频率极低［12，13］。在其PAH基因编码区还发现1个错义突变c.842C＞T（p.Pro281Leu），为杂合子，经SIFT和Polyphen对其进行蛋白功能预测，结果均显示为有害。已有该位点致病性的相关报道，且其在人群中发生频率极低［14］。而在胎儿羊水细胞未发现PAH基因上的无义突变c.781C＞T（p.Arg261Ter）和错义突变c.842C＞T（p.Pro281Leu），胎儿为携带者。在ACH家系中，ACH患者胎儿羊水样本在FGFR3基因外显子10未发现序列异常，未遗传到母亲突变位点c.1138G＞A（Gly380Arg），其母亲的突变位点是与目前的研究报道相一致的，99%的ACH是由于成纤维细胞生长因子受体3基因（FGFR3）第l0外显子发生G1138A（98%）或G1138C（1%）突变，导致跨膜区第380位密码子甘氨酸被精氨酸取代［15］。从以上研究结果可以看出，苯丙酮尿症和先天性软骨发育不全以点突变为主要突变形式，并可见到明显的突变热点，而脊髓性肌萎缩症98.6%的患者存在SMN1基因纯合缺失，这些突变基因谱提示不同的单基因遗传病致病基因的突变特点是不同的，某些致病基因在一个种族人群中的突变性质、分布、热点及其与其他民族地区的差异，对遗传病诊断、遗传咨询和建立有效的基因诊断程序是非常重要的。在临床检测中，对于基因拷贝数发生变化的单基因病，可应用DHPLC技术具有较高的灵敏度和特异度，而点突变的检测采用直接测序法方法简单，结果可靠。

总之，根据不同单基因病的突变特点，应用DHPLC技术以及直接测序法对其进行分析，可快速、准确做出判断，基因诊断已成为有效的诊断性检查，且在孕早期绒毛活检，孕中期羊膜腔穿刺以及孕晚期脐带血采集这些为单基因病产前诊断提供了安全，有效的保证，值得临床推广应用。

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ObjectiveTo investigate methods for prenatal diagnosis of spinal muscular atrophy（SMA），PKU and achondroplasia（ACH）.MethodDifferent test methods are applied based on different mutational pattern.The chorionic villus of 1 fetus with SMA positive family history was collected.The exon 7 of telomeric survial motor neuron（SMN1）gene was detected by DHPLC.Normal member and SMA patient were selected as controls.The hot mutation in exon 10 of FGFR3 gene and PAH gene were detected by DNA sequencing in patients，normal phenotype individuals and pregnancy fetus.Results‘Homozygous deletion of the SMN1 exon7 wasn′t detected in pregnancy fetus.The pedigree diagnosed as negative continued to pregnancy，and gave birth to a normal baby.c.781C＞T（p.Arg261Ter）and c.842C＞T（p.Pro281Leu）mutations of PAH gene were detected in patient with PKU positive family history.Fortunately，Sequencing analysis revealed the fetus shows the mutation of PAH gene as same as his mother c.842C＞T（p.Pro281Leu）.The pedigree diagnosed as carrier continued to pregnancy.The mother of the fetus diagnosed as achondroplasia had G1138A mutation，but the fetus had normal nucleotide at nucleotide 1138 in exton 10 of FGFR3，therefore were excluded from achondroplasia.ConclusionsThe application of different test methods is efficient and practical ways in different monogenic disease.

monogenic disease；prenatal molecular diagnosis；spinal muscular atrophy；PKU；achondroplasia

R714.55

A

2014-06-10）

编辑：邹刚

10.13470／j.cnki.cjpd.2014.04.011

陕西省科技统筹创新工程（2012KTCL03-09）

*通讯作者：张建芳，E-mail：zhangjf＠fmmu.edu.cn