高效液相色谱法测定甲磺酸伊马替尼脂质体含量及有关物质

方夏琴,刘盟盟,张秀立,吴一飞,郑稳生

(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所,药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室,北京 100050)

高效液相色谱法测定甲磺酸伊马替尼脂质体含量及有关物质

方夏琴,刘盟盟,张秀立,吴一飞,郑稳生

(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所,药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室,北京 100050)

目的 建立高效液相色谱(HPLC)法,检测甲磺酸伊马替尼脂质体的含量及有关物质。方法Kromasil C18柱,流动相A为辛烷磺酸钠溶液-甲醇(42∶58);流动相B为辛烷磺酸钠溶液-甲醇(4∶96);梯度洗脱,流速为1.2 mL·min-1,柱温室温,检测波长268 nm。结果在选定的色谱条件下,甲磺酸伊马替尼专属性良好,在线性范围1～100 μg·mL-1内线性关系良好,r=0.999 1(n=5)。结论该方法用于检测甲磺酸伊马替尼脂质体的含量及有关物质准确、灵敏、可靠。

伊马替尼,甲磺酸;含量测定;有关物质;色谱法,高效液相

甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate,商品名: Glivec,格列卫)是一种口服的新型酪氨酸激酶抑制药。目前已知的主要不良反应包括血液学毒性和非血液学毒性[1-6]。将甲磺酸伊马替尼制成脂质体,可减少甲磺酸伊马替尼不良反应,增加治疗应用[7]。

笔者在本实验中建立测定甲磺酸伊马替尼脂质体含量及有关物质的高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法,实验表明该方法专属性强,准确、灵敏,操作简单。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100系列高效液相色谱仪、ChemStation色谱工作站;旋转蒸发仪(EYELA N-1000,日本东京理化器械株式会社);高压匀质机(Niro NS2006L,意大利GEA Niro Soavi公司);葡聚糖凝胶G-50颗粒,葡聚糖凝胶柱(40 cm×16 cm)(称取葡聚糖凝胶颗粒5 g,纯化水浸泡24 h,湿法装柱,待用)。

1.2 试药 大豆卵磷脂(soybean phosphatidylcholine, SPC,北京化学试剂公司,生化试剂,批号:100708,纯度:98%);胆固醇(cholesterol,Chl,北京化学试剂公司,生化试剂,批号:101012,纯度:98%);甲磺酸伊马替尼标准品(加拿大TRC公司标准品,含量>99%,批号:FI10812);甲磺酸伊马替尼原料药(北京华威锐科化工有限公司,含量>98.0%,批号:100302);甲磺酸伊马替尼脂质体(中国医学科学院药物研究所自制,批号:110501,浓度:1.5 mg·mL-1);曲拉通X-100 (北京化学试剂公司,试剂级,使用时用乙醇配制成10%的曲拉通溶液,批号:091213,纯度≥98%)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18柱(150 mm× 4.6 mm,5 μm,Akzo Nobel公司);流动相A为辛烷磺酸钠溶液(取辛烷磺酸钠7.5 g,加水800 mL使溶解,用10%磷酸溶液调节pH至2.5,加水稀释至1 000 mL)-甲醇(42∶58);流动相B为辛烷磺酸钠溶液(取辛烷磺酸钠7.5 g,加水800 mL使溶解,用10%磷酸调节pH至2.5,加水稀释至1 000 mL)-甲醇(4∶96);室温,流速1.2 mL·min-1;检测波长268 nm;进样量:10 μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相时间梯度表Tab.1 Gradient program of mobile phase %

2.2 系统适应性实验 溶剂1:甲醇-0.1 mol·L-1盐酸(6∶4)。标准品的溶液配制:取甲磺酸伊马替尼标准品36 mg,精密称定,置于50 mL量瓶,加溶剂1溶解并定容,摇匀。取续滤液10 μL注入色谱仪,连续进样6次,主峰面积的相对标准偏差不得大于2.0%,甲磺酸伊马替尼标准品溶液色谱图见图1。

1.甲磺酸伊马替尼图1 甲磺酸伊马替尼标准品溶液液相色谱图1.Imatinib mesylateFig.1 HPLCchromatogramofImatinibmesylate reference solution

计算甲磺酸伊马替尼主峰峰面积和保留时间的RSD,分别为0.34%(n=6)和0.76%(n=6),符合相关要求,系统适应性良好。

2.3 专属性实验 吸取空白脂质体1 mL置于25 mL量瓶,加入甲醇溶解破乳后,以溶剂1稀释定容,振摇破乳,即得空白脂质体破乳液样品。

吸取空白脂质体1 mL于25 mL量瓶,以适量甲醇破乳后,加入70 μg·mL-1甲磺酸伊马替尼标准品溶液稀释定容,振摇破乳,即得含药空白脂质体样品。

吸取甲磺酸伊马替尼脂质体1 mL置25 mL量瓶中,加入甲醇溶解破乳后,以溶剂1稀释定容,振摇破乳,即得甲磺酸伊马替尼脂质体破乳液样品。

将上述溶液过滤后置进样瓶中,取10 μL进样,记录色谱图,见图2～4。

图2 空白脂质体破乳液液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of demulsification solution of liposome

1.甲磺酸伊马替尼图3 空白脂质体与甲磺酸伊马替尼标准品溶液的液相色谱图1.Imatinib mesylateFig.3 HPLC chromatogram of liposome and Imatinib mesylate reference

1.甲磺酸伊马替尼图4 甲磺酸伊马替尼脂质体破乳液液相色谱图1.Imatinib mesylateFig.4 HPLC chromatogram of demulsification solution of imatinib mesylate

2.4 线性关系考察 用溶剂1配制500 μg·mL-1甲磺酸伊马替尼标准品储备液,再用溶剂1稀释此储备液制备成浓度为1,5,10,50,100 μg·mL-1对照品溶液,分别进样10 μL,测定峰面积。以峰面积(A)为纵坐标,对照品浓度(C,μg·mL-1)为横坐标,进行线性回归,回归方程为:A=30.18C+8.689,r=0.999 1(n=5)。表明甲磺酸伊马替尼溶液浓度在1～100 μg·mL-1范围内,与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 回收率实验 精密移取9份1 mL空白脂质体,分别置9个10 mL量瓶中,分成3份,第1份各加入50 μg·mL-1甲磺酸伊马替尼标准品溶液8 mL(即含药40 μg·mL-1),第2份各加入50 μg·mL-1甲磺酸伊马替尼标准品溶液9 mL(即含药45 μg·mL-1),第3份各加入100 μg·mL-1甲磺酸伊马替尼标准品溶液6 mL(即含药60 μg·mL-1),再用甲醇溶解振摇破乳后以溶剂1稀释到刻度,进样10 μL,记录色谱峰面积,计算得回收率分别为101.3%,101.9%,100.4%,平均RSD为1.7%。由此可见,脂质体处方中的辅料对测定基本无干扰。

2.6 方法重复性实验 取标准品适量,精密称定,加溶剂1制成每毫升中含50 μg的溶液作为重复性样品溶液。精密量取10 μL,注入液相色谱仪,连续进样6次,以峰面积计算得RSD为0.24%(n=6)。

2.7 精密度实验 取本品适量,精密称定,加溶剂1制成为每毫升含50 μg的溶液作为供试品溶液。精密量取10 μL,注入液相色谱仪,连续进样6次,以峰面积计算得RSD为0.51%(n=6)。

2.8 供试品溶液稳定性实验 取甲磺酸伊马替尼脂质体适量,甲醇破乳后以溶剂1稀释至成每毫升含50 μg的溶液,分别在0,2,4,8,12,24 h进样,记录色谱图,测定峰面积得RSD为0.36%,表明本品室温放置在24 h内稳定性良好。

2.9 检测限和定量限 取“2.4”项溶液逐级稀释,按S/N≈10测得甲磺酸伊马替尼的定量限为0.06 μg·mL-1,按S/N≈3测得甲磺酸伊马替尼的检测限为0.02 μg·mL-1。

2.10 含量测定 取甲磺酸伊马替尼脂质体4 mL置100 mL量瓶中,甲醇适量破乳后以溶剂1稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。精密量取10 μL注入液相色谱仪,记录图谱。另取甲磺酸伊马替尼标准品,用溶剂1溶解,并稀释至浓度为0.06 mg·mL-1,同法测定,按外标法以峰面积计算出脂质体中甲磺酸伊马替尼的含量,结果4批产品的含量分别为76.32%,75.10%, 80.62%,78.79%,表明均一性较好。

2.11 有关物质测定 取甲磺酸伊马替尼脂质体40 mL置100 mL量瓶,甲醇适量破乳后用溶剂1稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。取供试品溶液1 mL置100 mL量瓶,用溶剂A稀释至刻度,作为1%对照溶液,各精密量取10 μL注入液相色谱仪,调整仪器灵敏度,使主成分峰的峰高为记录仪满量程的20%,记录色谱至主峰保留时间的2倍。供试品溶液中各杂质峰的峰面积之和,不得大于对照溶液主峰的峰面积(总杂质＜1%),结果4批产品的有关物质总杂质分别为0.24%,0.22%, 0.22%,0.21%。

3 讨论

采用本方法能准确测得甲磺酸伊马替尼的含量和有关物质,专属性良好,线性关系、回收率、稳定性均能满足要求。甲磺酸伊马替尼脂质体在本方法检测条件下,含量达70%,有关物质亦能满足要求。

本实验曾使用了多组流动相进行筛选,采用的流动相主峰分离度较好,峰形尖锐,保留时间适中,能满足分析的要求。与其他方法比较,本法将梯度波动远离主药保留时间,使得溶剂峰不干扰主峰的测定。

经本方法测得的甲磺酸伊马替尼脂质体含量较高,制剂的有关物质能得到有效控制。

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[3] VANOOSTEROM A T,JUDSON I R,VERWEIJ J,et al. Update of phase I study of imatinib(ST1571)in advanced soft tissue sarcomas and gastrointestinal stromal tumors:a report of the EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group [J].Eur J Cancer,2002,38(Suppl 5):S83-S87.

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.026

Determination of Imatinib Mesylate Liposome and Related Substances by HPLC

FANG Xia-qin,LIU Meng-meng,ZHANG Xiu-li,WU Yi-fei,ZHENG Wen-sheng
(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing City Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Novel Formulations,Beijing 100050,China)

ObjectiveTo establish a method for determination of imatinib mesylate liposome and related substances.MethodsThe liquid chromatography was carried out on a Kromasil C18column.The mobile phase A consisted of methanoloctane sulfonate solution(42∶58).The mobile phase B consisted of methanol-octane sulfonate solution(4∶96).The flow rate of gradient elution was 1.2 mL·min-1.The detection wavelength was 268 nm.The column temperature was room temperature.ResultsThe intermediates and degraded substances could be seperated under the selected chromatographic conditions.Imatinib mesylate showed a good linear relationship within 1-100 μg·mL-1,r=0.999 1(n=5).ConclusionThe method is specific, accurate,sensitive,and simple,and can be used for quality control of imatinib mesylate liposome.

Imatinib,mesylate;Determination;Related substances;HPLC

R979.1;R927.2

B

1004-0781(2014)11-1495-03

2013-09-09

2013-10-22

方夏琴(1986-),女,安徽潜山人,硕士,主要研究方向:药物传输技术与新型制剂。电话:010-63165233,E-mail:fangxiaqin@163.com。

郑稳生(1966-),男,安徽潜山人,研究员,博士,主要研究方向:药物传输技术与新型制剂。电话:010-63165233,E-mail:zhengwensheng@imm.ac.cn。