高效液相色谱法测定阿托伐他汀钙中间体L1的相关物质

任汉城，赵海龙

(浙江金立源药业有限公司，上虞 312300)

高效液相色谱法测定阿托伐他汀钙中间体L1的相关物质

任汉城，赵海龙

(浙江金立源药业有限公司，上虞 312300)

目的 建立高效液相色谱法测定阿托伐他汀钙中间体L1的有关物质。方法采用Agilent Poroshell ECC18色谱柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm),以水∶乙腈∶四氢呋喃∶甲醇(36∶8.4∶29∶26.6,为流动相,流速为0.7 mL·min-1,检测波长为246 nm,柱温为30℃。结果阿托伐他汀钙中间体L1和已知杂质L1-双胺、L1-脱氟、L1-R,S、L1-双氟互相之间分离度良好,L1-双胺在0.124 1～1.488 0 μg·mL-1的浓度范围内呈良好的线性关系(R2=0.999 5,n=7),L1-脱氟在0.386 6～3.093 0 μg·mL-1的浓度范围内呈良好的线性关系(R2=1,n=6),L1-R,S在0.357 1～2.856 0 μg·mL-1的浓度范围内呈良好的线性关系(R2=0.999 0,n=6),L1-双氟在0.187 3～1.498 0 μg·mL-1的浓度范围内呈良好的线性关系(R2=0.999 3,n=6),各杂质的控制限度均达到定量限。结论该方法各杂质及中间体L1互相之间分离度良好,方法准确、可靠。

阿托伐他汀钙中间体；色谱法,高效液相；有关物质

阿托伐他汀钙是由美国Warner-Lambert公司和Pfizer公司于1997年共同开发上市的调血脂药,因其能够同时降低总胆固醇和低密度脂蛋白的含量,具有高活性、低毒、低副作用等优点,是市场上销售最好的HMG-CoA还原酯抑制药。连续7年全球年销售额达百亿,其研究愈发引起人们关注[1]。中间体L1被广泛用于合成该药,中间体L1分子式为C11H17N3,化学名为(4R-cis)-6-[2-[2-(4-氟苯基)-5-(1-异丙基)-3-苯基-4-[(苯胺)羰基]-1H-吡咯-1-基]乙基]-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯。控制好其质量是确保阿托伐他汀钙相关杂质低和产品纯度高的必要前提,对于阿托伐他汀钙原料药生产过程的控制具有较重要的意义。张明颖等[2]建立了关于阿托伐他汀钙中间体L1有关物质的检测方法,但作者只验证了主峰L1的专属性,并未考察4种已知杂质L1-双胺、L1-R,S、L1-脱氟、L1-双氟相互之间的分离度,方法有待进一步改进。笔者未见国内及国外关于L1有关物质检查的详细方法及其验证的报道。其中L1与L1-R,S由于结构极其相似,分离难度极大,笔者建立了一个良好的分离方法,方法专属性强,4种已知杂质及L1相互之间分离度良好,各杂质与未知杂质之间的分离度也均大于1.0,能有效地控制产品质量。

1 实验材料

Agilent 1260高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)。L1、L1-R,S、L1-脱氟、L1-双氟、L1-双胺均为公司自制并已做结构确证,含量按色谱纯度计,分别为99.09%,96.21%,100.0%,99.09%,97.53%；阿托伐他汀钙中间体L1(公司自制,批号:20100701)；乙腈、甲醇、四氢呋喃均为色谱级；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性实验 色谱柱:Agilent Poroshell EC-C18色谱柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm)；流动相:水∶乙腈∶四氢呋喃∶甲醇(36∶8.4∶29∶26.6)；流速:0.7 mL·min-1；检测波长:246 nm；柱温:30℃；进样量:10 μL；溶剂:乙腈∶水(80∶20)；理论板数按L1计不少于18 000。

2.2 专属性考察 分别配制溶剂、0.5 mg·mL-1L1供试品溶液及L1与4个杂质的混合溶液(0.5 mg·mL-1L1+0.3%L1-R,S+0.3%L1-脱氟+ 0.15%L1-双氟+0.10%L1-双胺)各10 μL,在上述色谱条件下进行测定。结果溶剂、L1及4种已知杂质均得到良好分离。见图1。

2.3 线性关系考察 取4种杂质样品适量,加溶剂溶解并稀释成含L1-R,S2.856 0 μg·mL-1、L1-双胺0.992 9 μg·mL-1、L1-脱氟3.093 0 μg·mL-1、L1-双氟1.498 0 μg·mL-1的混合溶液作为200%浓度溶液,依次稀释成150%、100%、75%、50%、25%浓度溶液,取L1-双胺适量加溶剂溶解并稀释成1.488 0 μg·mL-1的溶液,分别以10 μL进样,以浓度(C,μg·mL-1)对峰面积(A)进行线性回归,线性方程分别为:

结果表明L1-双胺在0.124 1～1.488 0 μg·mL-1的浓度范围内与峰面积线性关系良好；L1-脱氟在0.386 6～3.093 0 μg·mL-1的浓度范围内与峰面积线性关系良好；L1-R,S在0.357 1～2.856 0 μg·mL-1的浓度范围内与峰面积线性关系良好；L1-双氟在0.187 3～1.498 0 μg·mL-1的浓度范围内与峰面积线性关系良好。

2.4 精密度实验 取线性关系考察实验中的100%溶液,按样品测定方法,重复测定6次,以峰面积计算: RSDL1-双胺为2.20%,RSDL1-脱氟为0.79%,RSDL1-R,S为0.93%,RSDL1-双氟为4.17%,均小于5.0%。

2.5 检测限(limit of detection,LOD)及定量限(limit of quantitation,LOQ) 以信噪比3为LOD,以信噪比10为LOQ,L1-R,S的LOD为0.632 8 ng,LOQ为2.848 ng；L1-脱氟的LOD为0.685 1 ng,LOQ为3.083 ng；L1-双氟的LOD为0.996 4 ng,LOQ为3.736 ng；L1-双胺的LOD为0.992 8 ng,LOQ为3.723 ng。

2.6 回收率实验 精密称取阿托伐他汀钙中间体L1约25 mg 10份,精密加入各杂质混合溶液(80%, 100%,120%各3份,不加样1份),分别置50 mL量瓶中,溶解并稀释至刻度,作为回收率供试液；另配制100%杂质混合对照溶液2份。按外标法进行回收率测定,结果均在90%～100%,见表1。

图1 溶剂(A)、L1(B)、L1-双胺(C)、L1-R,S(D)、L1-双氟(E)、L1-脱氟(F)、L1及各杂质混合液(G)高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of diluent(A)、L1(B)、L1-diamination(C)、L1-R,S(D)、L1-difluoration(E)、L1-defluoration (F)and mixed solution of L1 and related substances(G)

表1 回收率测定结果Tab.1 Results of recovery experiment %

2.7 有关物质检测 取样品约25 mg,精密称定,于50 mL量瓶中,加溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀,按照本法进行检测,记录色谱时间60 min,按外标法计算各杂质的含量,纯度按面积归一化法计,结果3批样品中有关物质情况见表2。

3 讨论

经过详细的实验研究,发现四氢呋喃和乙腈、甲醇对4种杂质的分离选择性有很大差异。实验结果表明,当流动相为水∶乙腈∶四氢呋喃∶甲醇(36∶8.4∶29∶26.6)时,主成分及4种已知杂质互相之间能获得理想的分离效果。

表2 3批样品检测结果Tab.2 Determination results of three batches of samples %

本研究采用HPLC法建立了阿托伐他汀钙中间体L1的有关物质检查方法,结果表明所建立的方法准确、重复性好,可用于L1的质量控制。控制好中间体L1的质量是确保阿托伐他汀钙有关物质含量低和产品纯度高的必要前提。本研究对于阿托伐他汀钙原料药生产过程的控制具有较重要的意义。

[1] 夏正君,马堰启,林送,等.阿托伐他汀钙非对映异构体(3S,5R)的全合成[J].广东化工,2012,10(39):29.

[2] 张明颖,孙国祥.HPLC法测定阿托伐他汀钙3种中间体的含量和有关物质[J].中国药房,2013,24(1):83.

DOI 10.3870/yydb.2014.04.026

Content Determination of Related Substances of Atorvastatin Calcium Intermediate L1 by HPLC

REN Han-cheng,ZHAO Hai-long
(Zhejiang Kinglyuan Pharmaceutical Co.,Ltd,Shangyu 312300,China)

Objective To establish a high performance liquid chromatography(HPLC)method for determination of the related substances of atorvastatin intermediate L1.MethodsThe chromatographic separation was performed on Agilent Poroshell EC-C18column(100 mm×4.6 mm,2.7 μm)with the mobile phase consisting of H2O∶ACN∶THF∶MeOH(36∶8.4∶29∶26.6).The flow rate was 0.7 mL·min-1,the detection wavelength was 246 nm,and the column temperature was 30℃.ResultsThe method achieved good separation between L1 and its related impurites including L1-defluorination,L1-R,S,and L1-diamination.The linear range was 0.124 1-1.488 0 μg·mL-1(R2=0.999 5,n=7),0.386 6-3.093 0 μg·mL-1(R2=1,n=6),0.357 1-2.856 0 μg·mL-1(R2=0.999 0,n=6),and 0.187 3-1.498 0 μg·mL-1(R2=0.999 3,n=6)for L1-diamination,L1-defluorination,L1-R,S,and L1-difluorination,respectively.The specifications of each impurity all reached the LOQ.ConclusionL1 separates well with the impurities.The method is accurate and reliable.

Atorvastatin calcium intermediate;Chromatography,high performance liquid;Related substances

R972.6;R927.2

A

1004-0781(2014)04-0498-03

2013-08-28

2013-10-25

任汉城(1984-),男,福建长汀人,助理工程师,学士,研究方向:分析方法开发。电话:(0)15857534689,E-mail：renhancheng1314@163.com。