豨莶草提取物对抗多柔比星致大鼠急性肝肾损伤的作用及其机制*

于静，王建欣，苏素文，谢克让，张玉，杨继章，苏悦

(1.河北医科大学第一医院药剂科，石家庄 050031；2.河北医科大学基础医学院药理教研室，石家庄 050017；3.河北省计划生育科学技术研究院生殖医学中心，石家庄 050050)

豨莶草提取物对抗多柔比星致大鼠急性肝肾损伤的作用及其机制*

于静1，王建欣1，苏素文2，谢克让2，张玉3，杨继章1，苏悦2

(1.河北医科大学第一医院药剂科，石家庄 050031；2.河北医科大学基础医学院药理教研室，石家庄 050017；3.河北省计划生育科学技术研究院生殖医学中心，石家庄 050050)

目的 探讨豨莶草(HS)提取物对多柔比星(DOX)所致大鼠急性肝肾损伤的影响及其机制。方法将40只大鼠随机分为4组,各10只:HS提取物低、高剂量组分别灌胃给予HS提取物170和340 mg·kg-1,对照组、模型组灌胃给予等容积纯化水,连续7 d。给药第5天,除对照组腹腔注射0.9%氯化钠溶液外,其他3组均腹腔注射DOX 20 mg·kg-1。于第7天将大鼠麻醉后测定血清各种生化指标、过氧化产物及自由基的含量以及肝脏、肾脏组织过氧化产物及自由基的含量。结果与模型组比较,HS提取物高、低剂量组血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及尿素氮(BUN)水平均较低,肝脏及肾脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及丙二醛(MDA)水平均较模型组有所恢复。肝脏组织病理结果显示HS提取物高、低剂量组可不同程度缓解DOX所致的充血肿胀,肾脏组织病理结果显示HS提取物高、低剂量组可不同程度缓解DOX所致的炎细胞浸润及出血,都以高剂量组作用最为明显。结论HS可明显减轻DOX所致大鼠急性肝肾损伤,其作用机制可能是由于HS提取物能增强机体的抗氧化应激能力。

豨莶草；多柔比星；损伤,肝；损伤,肾；氧化应激

多柔比星(doxorubicin,adriamycin,DOX),又名羟柔红霉素、阿霉素,是一种高效广谱的蒽环类抗肿瘤药物[1]。近年来其心脏毒性已日趋引起人们的重视。笔者在应用DOX制备大鼠心肌病模型时,发现对大鼠肝肾损害也相当严重。豨莶草(Herba siegesbeckiae, HS)性味苦寒,归肝、肾经,有祛风湿、通经络、清热解毒等功效,而酒蒸制后性味甘温,又兼有补益肝肾、强筋壮骨之效。于雪峰等[2]研究发现复方豨莶草胶囊能改善高尿酸血症肾损害大鼠的肾功能,且可使其肌酐、尿素氮水平接近正常。然而,HS提取物对DOX所致的急性肝肾损伤是否有对抗作用笔者尚未见报道。因此,本研究拟通过DOX单次给药致大鼠急性肝肾损伤模型,观察HS提取物对DOX所致的急性肝肾损伤是否有保护作用,并从氧化应激的角度对其作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性Sprague-Dwaley(SD)大鼠40只,体质量250～350 g,由河北省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(冀2008-1-003)。动物合格证号: 808046。实验前适应性喂养1周。

1.2 试药 DOX购于浙江海正药业股份有限公司,批号:110703,临用前用0.9%氯化钠溶液配制而成；HS由河北祁新中药颗粒饮片有限公司提供,产地:湖北,批号:20120701-1,由河北医科大学第一医院药剂科杨继章主任药师鉴定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒均购于南京建成生物工程公司；生化测定试剂尿素氮(urea nitrogen,BUN)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)均为日本SYSMEX公司的原装进口试剂。

1.3 HS提取物的制备 豨莶草2 kg水煎2次后浓缩至4 L,加入95%乙醇,边加边剧烈搅拌至乙醇浓度为70%,过滤后回收乙醇,置烘干盘中入烘箱烘干,收集粉碎并称质量,共收集HS提取物70 g。实验前用纯化水溶解配制到所需浓度。

1.4 动物模型制备及分组 实验动物适应性喂养1周后按体质量随机分为4组:对照组、模型组、低剂量药物组、高剂量药物组,每组10只。低、高剂量药物组分别灌胃给予HS提取物170和340 mg·kg-1[3]。对照组、模型组灌胃给予等容积纯化水,qd,连续7 d,灌胃容积均为2 mL·(100 g)-1。给药第5天除对照组外,其他3组均腹腔注射DOX 20 mg·kg-1,对照组则腹腔注射相同体积的0.9%氯化钠溶液。

1.5 血清及组织匀浆制备 末次给予HS提取物30 min后,将大鼠用1%戊巴比妥钠(5 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后仰位固定于操作盘里,剖开动物的腹腔,自腹主动脉取血约5 mL,将血液静置约30 min后离心10 min(3 000 r·min-1,r=12.5 cm),取上清液(血清)以备测定血清生化指标(BUN、ALT、AST)。之后取出肝脏、肾脏,用滤纸吸干水分,部分组织用冰0.9%氯化钠溶液制备成10%匀浆液,组织充分裂解后离心10 min(3 000 r·min-1,r=12.5 cm),取上清液以备测定组织中抗氧化酶(SOD、MDA、CAT)活性[4]。另取部分组织用10%甲醛溶液固定,以备观察组织病理学改变。

1.6 取材与石蜡切片制作 将部分肝脏、肾脏组织迅速放入10%甲醛溶液中固定24～72 h。常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋。切片机上行5 μm厚冠状切片。切片常规脱蜡,苏木精染色,盐酸乙醇分色,氨水返蓝,伊红复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中型树胶封片。在光学显微镜下观察细胞形态变化。

1.7 观察指标与测定方法 ALT的测定采用乳酸盐脱氢酶-紫外分光光度(LDH-UV)法,AST的测定采用苹果酸脱氢酶-紫外分光光度(MDH-UV)法,BUN的测定采用尿素酶-谷氨酸脱氢酶(Urease-GLDH)法。SOD的测定采用黄嘌呤氧化酶法,CAT测定采用可见光法,MDA的测定采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法。

2 结果

2.1 血清生化指标 与对照组相比,模型组大鼠血清中ALT、AST及BUN均升高(均P＜0.01)。而低剂量药物组血清中ALT、BUN(均P＜0.05)及AST(P＜0.01)水平降低,高剂量药物组血清中ALT、AST、BUN水平降低更加明显(均P＜0.01)。见表1。

2.2 HS对DOX致急性肝肾损伤大鼠肝损伤的影响

2.2.1 肝脏组织过氧化产物及自由基的含量测定 与对照组相比,模型组大鼠肝脏组织的SOD、CAT水平显著下降(均P＜0.01),MDA水平显著升高(P＜0.01)；与模型组相比,低剂量药物组SOD(P＜0.01)、CAT(P＜0.05)水平升高,MDA(P＜0.05)水平降低。而高剂量药物组SOD、CAT的水平显著升高(均P＜0.01),MDA水平显著降低(P＜0.01)。结果见表2。

2.2.2 肝脏病理切片 对照组大鼠肝细胞排列有序,未见瘀血等现象。模型组大鼠肝细胞可见间隙出血,瘀血扩张,偶见坏死现象。低、高剂量药物组肝组织间隙出血现象明显减轻,未见明显坏死现象,以高剂量药物组作用最为明显。结果见图1。

表1 4组大鼠血清生化指标的检测值Tab.1 Results of serum biochemical indicators in four groups of rats ±s

表1 4组大鼠血清生化指标的检测值Tab.1 Results of serum biochemical indicators in four groups of rats ±s

与模型组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01;与对照组比较,*3P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with control group,*3P＜0.01

组别大鼠/只剂量/(mg·kg-1) ALTAST (U·L-1) BUN/(mmol·L-1)低剂量药物组10 17064.79±21.31*1177.72±36.87*220.07±7.16*1高剂量药物组10 34060.00±13.35*2133.20±28.67*211.87±3.68*2模型组7 …90.96±20.05*3265.43±70.13*335.17±15.29*3对照组10 …58.29±20.27104.70±23.695.30±0.98

2.3 HS对DOX致急性肝肾损伤大鼠肾损伤的影响

2.3.1 肾脏组织过氧化产物及自由基的含量测定与对照组相比,模型组大鼠肾脏组织中SOD、CAT水平显著下降(均P＜0.01),MDA水平显著升高(P＜0.01)；与模型组比较,低剂量药物组CAT水平升高(P＜0.01),MDA水平降低(P＜0.05),对SOD水平未见明显影响(P＞0.05),而高剂量药物组SOD、CAT水平显著升高(均P＜0.01),MDA水平显著降低(P＜0.01),SOD、CAT、MDA水平都接近正常组。见表3。

2.3.2 肾脏病理切片 对照组肾间质未见出血、肿胀。模型组肾间质内有片状出血,而低、高剂量药物组均明显缓解,以高剂量药物组作用更为明显。结果见图2。

3 讨论

本研究结果表明,DOX可引起大鼠血清中ALT、AST和BUN升高,提示DOX可引起严重的肝、肾损伤。而HS低剂量即可降低血清中ALT、AST及BUN的水平,HS高剂量可进一步降低血清中ALT、AST及BUN的水平,提示HS提取物对DOX急性中毒所致的肝肾损伤可能有选择性修复作用。

对肝肾组织匀浆的分析结果表明,DOX可降低肝脏、肾脏组织中SOD、CAT的水平,升高MDA水平。DOX进入细胞后能促进活性氧和MDA生成,也能使SOD的活性降低,从而降低SOD的含量,导致氧化应激损伤,这一结果和以前的报道类似[5-6]。与模型组相比,HS高低剂量药物组均可升高血清中CAT、SOD水平,降低MDA水平,以高剂量药物组作用最佳。SOD的主要作用机制是把超氧阴离子(O2-)转换为过氧化氢(H2O2)。O2-具有细胞毒性,可使脂质过氧化,从而损伤细胞膜引起炎症、肿瘤和自身免疫性疾病,并可能促使机体衰老,所以其活性高低间接反映了机体清除自由基的能力。尽管H2O2仍是对机体有害的活性氧,但广泛存在于红细胞及某些组织内的CAT会立即将其分解为完全无害的水。从而将有毒性的O2-和H2O2均转化为无毒的水分子物质。MDA是多不饱和脂肪酸过氧化物的降解产物,与脂蛋白交联有毒性作用。生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应,氧化终产物为MDA,它会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合,且具有细胞毒性,其含量高低间接反映了机体脂质过氧化的程度和机体细胞受自由基攻击的严重程度。故此以上指标的变化提示DOX所致肝肾损伤与氧化应激过强有关。而HS提取物不仅能有效清除自由基,保护细胞膜,还能通过增强抗氧化酶SOD和CAT的活性,提高清除自由基的能力,使脂质过氧化产物MDA含量降低,从而达到保护机体的作用。提示HS提取物对抗DOX所致大鼠急性肝肾损伤的作用机制可能与其增强抗氧化酶的活性,清除自由基,抑制脂质过氧化有关。

表2 4组大鼠肝脏组织过氧化产物及自由基的检测值Tab.2 Results of overoxidation product and free radical in heptic tissue of four groups of rats ±s

表2 4组大鼠肝脏组织过氧化产物及自由基的检测值Tab.2 Results of overoxidation product and free radical in heptic tissue of four groups of rats ±s

与模型组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01;与对照组比较,*3P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with control group,*3P＜0.01

组别大鼠/只剂量/(mg·kg-1) MDA/(nmol·mL-1) CATSOD (U·mL-1)低剂量药物组10 17033.60±3.44*188.91±6.87*1205.02±16.01*2高剂量药物组10 34026.83±3.50*2100.23±7.04*2235.89±15.93*2模型组7 …40.54±6.37*378.88±8.74*3176.08±16.42*3对照组10 …27.93±3.67108.56±8.40251.94±11.86

A.对照组;B.模型组;C.低剂量药物组;D.高剂量药物组图1 4组大鼠肝脏组织切片图(HE,×40)A.control group；B.model group；C.low dose drug group；D.high dose drug groupFig.1 Histopathological section of heptic tissue in four groups of rats(HE,×40)

表3 4组大鼠肾脏组织过氧化产物及自由基的检测值Tab.3 Results of overoxidation product and free radical in renal tissue of four groups of rats ±s

表3 4组大鼠肾脏组织过氧化产物及自由基的检测值Tab.3 Results of overoxidation product and free radical in renal tissue of four groups of rats ±s

与模型组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01;与对照组比较,*3P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with control group,*3P＜0.01

组别大鼠/只剂量/(mg·kg-1) MDA/(nmol·mL-1) CATSOD (U·mL-1)低剂量药物组10 17030.72±3.24*145.82±5.16*227.96±7.71高剂量药物组10 34026.36±3.46*256.75±4.40*245.71±5.34*2模型组7 …36.58±5.54*334.39±4.15*322.48±6.39*3对照组10 …25.43±3.6258.59±6.0641.25±6.46

A.对照组;B.模型组;C.低剂量药物组;D.高剂量药物组图2 4组大鼠肾脏组织切片图(HE,×40)A.control group；B.model group；C.low dose drug group；D.high dose drug groupFig.2 Tissue slice image of renal tissue in four groups of rats(HE,×40)

对肝肾组织的组织病理学检查结果表明,DOX可引起大鼠肝组织和肾小球细胞的间质瘀血和炎细胞浸润,这说明DOX可引起组织细胞膜的毒性反应,破坏组织形态和功能的完整性,而HS提取物低、高剂量药物组均明显缓解,以高剂量药物组更为明显,从而表明HS对DOX所致的肝肾组织结构改变有选择性修复作用。

综上所述,HS提取物可对抗DOX所致大鼠急性肝肾损伤,其可能机制是通过抗氧化应激作用而对DOX所致的肝肾损伤产生保护。但是HS提取物的主要成分有萜类、苷类、生物碱等,到底是什么成分发挥抗氧化应激作用还有待进一步研究。

[1] QUILES J,HUERTAS J R,BATTINO M,et al.Antioxdant nutrients and adriamycin toxicity[J].Toxicology,2002,180 (1):79-95.

[2] 于雪峰,李登宇,孙贵,等.复方豨莶草胶囊降血尿酸及对肾损害的保护作用[J].中医药学报,2007,35(2):18-20.

[3] 于静,王婧,苏素文,等.豨莶草提取物抗多柔比星致大鼠急性心肌损伤的作用[J].医药导报,2013,32(7):843-847.

[4]LI J,LIU H,RAMACHANDRAN S,et al.Grape seed proanthocyanidins ameliorate doxorubicin-induced cardio-toxicity[J].Am J Chin Med,2010,38(3):569-584.

[5] AGAPITO M T,ANTOLIN Y,DEL BRIO M T,et al. Protective effect of melatonin against adriamycin toxicity in the rat[J].J Pineal Res,2001,31(1):23-30.

[6] WANG L H,YU C H,FU Y,et al.Berberine elicits antiarrhythmic effects via IK1/Kir2.1 in the rat type 2 diabetic myocardial infarction model[J].Phytother Res,2011,25 (1):33-37.

DOI 10.3870/yydb.2014.04.003

Preventive Role of Extracts from Herba Siegesbeckiae Against Acute Hepatic and Renal Injury Induced by Doxorubicin in Rats

YU Jing1,WANG Jian-xin1,SU Su-wen2,XIE Ke-rang2,ZHANG Yu3,YANG Ji-zhang1,SU Yue2
(1. Department of Pharmacy,the First Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050031,China;2. Department of Pharmacology,Basic Medical College of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China; 3.Hebei Family Planning Research Institute of Science and Technology in Reproductive Medicine Center, Shijiazhuang 050050,China)

Objective To investigate the potential protective effect of extracts fromHerba siegesbeckiae(HS)on hepatic and renal injury induced by doxorubicin(DOX)in rats.MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups with 10 in each.Rats in the low and high dose groups were intragastrically administered with HS extract at the doses of 170 and 340 mg·kg-1·d-1,respectively,for 7 consecutive days.Rats in the control and model groups were given with equal amount of water.On the 5th day,all groups were given with DOX(20 mg·kg-1)intraperitoneally except the control,which was given equal amount of saline.On the 7th day,evaluation of hepatic and renal protection effects by HS extract was performed by analyzing the serum biochemical indicators,contents of preoxidation(MDA),and free radicals in both serum and tissues of the liver and the kidneys.ResultsPretreatment with HS showed significant decrement of serum BUN、ALT and AST levels in a dose-dependent manner compared with DOX group.The increment of MDA production and decrements of SOD and CAT caused by DOX were also recovered dose dependently in HS treated groups.The hepatic cells in the DOX group showed obvious congestion and swelling,whereas the symptoms in HS group were significantly relieved in a dose dependent manner.The renal interstitial in the DOX group showed obvious congestion and swelling,however the symptoms in HS group were significantly relieved.There was no obvious congestive swelling phenomenon in high dose of HS group.ConclusionHS has protective effect against DOX-induced hepatic and renal toxicities in rats which may be caused by its anti-oxidative effect.

Herba siegesbeckiae;Doxorubicin;Hepatic injury;Renal injury;Oxidative stress

R282.71;R285.5

A

1004-0781(2014)04-0422-05

2013-06-10

2013-09-30

*河北省中医药管理局基金资助项目(2012008)；河北省自然科学基金资助课题(C2011206145)

于静(1982-),女,河北唐山人,主管药师,硕士,研究方向:心血管药理学。电话:0311-85917354,E-mail：38565914@qq.com。

苏素文(1971-),女,河北行唐人,教授,博士,硕士生导师,研究方向:心血管药理学及药物毒理学。电话: 0311-86265644,E-mail：suswmk@163.com。