马鞭草总黄酮对大鼠脓毒性急性肺损伤的保护机制

宋兆华，朱宝安

(漯河医学高等专科学校，漯河 462002)

马鞭草总黄酮对大鼠脓毒性急性肺损伤的保护机制

宋兆华，朱宝安

(漯河医学高等专科学校，漯河 462002)

目的 观察马鞭草总黄酮对大鼠脓毒性急性肺损伤(ALI)的保护作用和机制。方法将120只大鼠随机分为6组,分别为假手术组(0.9%氯化钠溶液),模型组(0.9%氯化钠溶液),地塞米松阳性对照组(2.0 mg·kg-1,ip),马鞭草总黄酮低、中、高剂量组(50.0,100.0,150.0 mg·kg-1,ip),盲肠结扎穿孔法(CLP)建立脓毒症诱发ALI大鼠模型,造模24 h后给药,48 h后处死,观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞、蛋白含量和肺湿/干质量比(W/D),比较炎症递质水平、抗氧化作用以及肺组织核转录因子(NF-κB)p65表达和细胞凋亡率。结果马鞭草总黄酮能显著降低BALF中白细胞、蛋白含量和肺组织W/D(P＜0.05或P＜0.01),降低巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)、细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平(P＜0.05或P＜0.01)以及肺组织细胞凋亡率和NF-κB p65表达(P＜0.05或P＜0.01),改善丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和髓过氧化物酶(MPO)活性(P＜0.05或P＜0.01)。尤其高剂量组效果明显(P＜0.01)。结论马鞭草总黄酮能降低脓毒性急性肺损伤大鼠的炎症递质水平,减轻脂质过氧化,改善肺泡毛细血管通透性,缓解ALI的发生、发展。

马鞭草总黄酮；损伤,肺,急性；脓毒性；保护机制

脓毒症是以感染为诱因的全身炎症反应综合征,表现为多脏器功能障碍和衰竭,其中肺脏最易受损,出现急性肺损伤(acute lung injury,ALI)或急性呼吸窘迫综合征[1]。肺泡毛细血管通透性、肺组织细胞凋亡[2]、巨噬细胞、中性粒细胞以及内皮细胞释放的大量促炎因子、炎症递质和趋化因子等在ALI的病理生理过程中起着关键作用。马鞭草(Verbena ofieinalisL.)为马鞭科植物马鞭草的全草或带根全草,黄酮化合物是马鞭草中的主要活性成分之一,具有抗肿瘤、抗氧化和抗炎作用[3]。笔者在本研究中通过盲肠结扎穿孔法(cecal ligation andpuncture,CLP)建立脓毒症诱发ALI大鼠模型,探讨马鞭草总黄酮对脓毒症后ALI的保护作用及机制,为ALI的临床治疗提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 动物 Sprague-Dawley(SD)大鼠120只,清洁级,雄性,体质量180～200 g,河南实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(豫)2010-0002。动物质量合格证号:0000897。

1.2 药品和试剂 马鞭草总黄酮(total flavones ofVerbena ofieinalisL.,TFV)由漯河医学高等专科学校天然药物化学实验中心提供,黄酮含量＞87.5%,0.9%氯化钠溶液配成所需浓度；地塞米松,购自天津天药药业股份有限公司(批号:110803)。巨噬细胞炎症蛋白-2 (macrophage inflammatory protein,MIP-2)、细胞间黏附分子-1(intercelluar adhesion molecule,ICAM-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号分别为: 110923,111201,120312,111209,120112,120213)。核转录因子(NF-κB)免疫组化试剂盒,购自北京中山生物技术公司(批号:110823)；原位末端转移酶标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)检测试剂盒,购自美国Roche公司(批号:120102)。

1.3 仪器 紫外-可见分光光度计(日本岛津)；550型酶标仪(Bio-Rad公司)；GL-7000型全自动生化分析仪(日本岛津公司)；GL20A型自动高速冷冻离心机(湖南湘江仪器厂)；AL104型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；Olympus BX41系统显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 模型的制备和分组 将120只SD大鼠随机分为6组:假手术组(SHAM组),脓毒症诱发ALI模型组(CLP组),地塞米松阳性对照组(DXMS组)和马鞭草总黄酮组低、中、高剂量组(TFV组:LTFV组、MTFV组、HTFV组)。均1%戊巴比妥钠80 mg·kg-1腹腔注射麻醉,假手术组大鼠开腹后立即关腹,模型组、阳性对照组和TFV组均采用CLP穿刺术制备大鼠脓毒症模型[4]。24 h后,大鼠出现倦怠、嗜睡、烦躁、呼吸急促、四肢末梢发绀,同时走路不稳、头颤等,并伴随竖毛、腹泻等。剖腹可见恶臭味血性渗液,肠管水肿,确定造模成功。

1.5 剂量的确定 参照《药理实验方法学》,预实验对大鼠经腹腔注射毒性试验测定大鼠对马鞭草总黄酮的最大耐受量(1 g·kg-1)以确定给药量,用其1/10作为中剂量,高、低剂量各为中剂量的3/2倍和1/2倍。

1.6 给药方法 造模24 h后,马鞭草总黄酮组按照50.0,100.0,150.0 mg·kg-1,ip；假手术组和模型组给予0.9%氯化钠溶液2 mL·kg-1,ip；阳性对照组给予地塞米松2.0 mg·kg-1,ip。

1.7 支气管肺泡灌洗液蛋白质、白细胞测定 各组大鼠给药48 h,戊巴比妥钠50 mg·kg-1,ip麻醉。行气管插管,抽取0.9%氯化钠溶液灌洗支气管肺泡,每次3 mL,共 6次,收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),离心,Lowry法测定上清液蛋白浓度。沉淀细胞用溶红细胞液破坏红细胞后采用血细胞计数板在光学显微镜下计数白细胞(white blood cell,WBC)。

1.8 肺组织湿/干质量比(W/D) 取右肺上叶,吸干表面水分称湿质量,置于80℃烤箱72 h烘干称干质量,计算W/D。

1.9 肺组织部分生化指标的测定 取右肺下叶250 mg冰浴匀浆制成10%溶液,4℃、12 000 r·min-1离心15 min,取上清液检测MIP-2,ICAM-1,TNF-α以及MDA、SOD和MPO的含量。

1.10 肺组织细胞凋亡检测和NF-κB p65的表达 左肺组织,用甲醛溶液固定,按常规方法石蜡包埋,切片,原位末端标记法测定肺组织细胞凋亡,免疫组化测定NF-κB p65的阳性表达。

1.11 统计学方法 采用SPSS 16.0版统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用One-way ANOVA,两两比较采用SNK法,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BALF中白细胞、蛋白含量和肺组织W/D的变化 与CLP组比较,SHAM组、DXMS组、TFV组BALF中白细胞、蛋白含量和肺组织W/D均差异有统计学意义(P＜0.05),其中TFV组伴随剂量的加大,差异性更加明显。HTFV组BALF中的白细胞、蛋白含量和肺组织W/D最低,与LTFV组比较差异有统计学意义(P＜0.05),但与MTFV组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 大鼠肺组织MIP-2、ICAM-1、TNF-α含量的变化 与CLP组比较,SHAM组、DXMS组、TFV组MIP-2,ICAM-1,TNF-α水平均差异有统计学意义(P＜0.05),其中TFV组伴随剂量的加大,差异性更加明显。TFV组组内比较,HTFV组MIP-2、ICAM-1、TNF-α的水平均最低,与LTFV组比较差异有统计学意义(P＜0.05),与MTFV组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

2.3 肺组织中MDA、SOD和MPO变化 与CLP组比较,SHAM组、DXMS组、TFV组MDA、MPO、SOD水平均差异有统计学意义(P＜0.05)。其中TFV组伴随剂量的加大,差异性更加明显。TFV组组内比较,HTFV组MDA和MPO水平最低,与LTFV组比较差异有统计学意义(P＜0.05),与MTFV组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表1 6组大鼠BALF中白细胞和蛋白含量、肺组织W/D比较Tab.1 Comparison of leukocyte,protein content and W/D of lung tissue among six groups of rats ±s

表1 6组大鼠BALF中白细胞和蛋白含量、肺组织W/D比较Tab.1 Comparison of leukocyte,protein content and W/D of lung tissue among six groups of rats ±s

与CLP组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01;与LTFV组比较,*3P＜0.05Compared with CLP group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with LTFV group,*3P＜0.05

组别大鼠/只剂量/(mg·kg-1)白细胞/(×107·L-1)蛋白含量/(mg·L-1)W/D LTFV组2050.05.11±0.35398.31±32.21*16.88±0.43 MTFV组20100.04.82±0.29*1331.23±31.22*26.06±0.37*1HTFV组20150.04.35±0.34*2*3307.26±28.57*2*35.38±0.31*2*3DXMS组202.04.29±0.31*2301.25±27.36*25.32±0.37*2CLP组200.05.68±0.26429.33±31.417.27±0.39 SHAM组200.04.18±0.27201.33±22.864.41±0.41

表2 6组大鼠肺组织MIP-2、ICAM-1、TNF-α含量的比较Tab.2 Comparison of MIP-2,ICAM-1,and TNF-α content in lung tissue among six groups of rats ±s

表2 6组大鼠肺组织MIP-2、ICAM-1、TNF-α含量的比较Tab.2 Comparison of MIP-2,ICAM-1,and TNF-α content in lung tissue among six groups of rats ±s

与CLP组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01;与LTFV组比较,*3P＜0.05Compared with CLP group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with LTFV group,*3P＜0.05

组别大鼠/只剂量/(mg·kg-1) MIP-2/(Pg·mL-1) ICAM-1/(ng·mL-1) TNF-α/(μg·L-1) LTFV组2050.022.31±5.95312.24±78.43*1311.25±43.57*1MTFV组20100.016.98±5.13*2*3259.74±89.48*2*3244.37±39.67*1HTFV组20150.011.68±5.21*2*3209.59±63.38*2*3198.46±31.16*2*3DXMS组202.011.19±5.91*2211.00±57.16*2197.12±33.55*2CLP组200.030.41±7.17511.46±83.18383.27±46.65 SHAM组200.05.37±1.1145.17±11.1391.33±23.12

表3 6组大鼠肺组织中MDA、SOD和MPO活性变化比较Tab.3 Comparison of the activity of MDA,SOD and MPO in lung tissue among six groups of ratsv ±s

与CLP组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01;与LTFV组比较,*3P＜0.05Compared with CLP group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with LTFV group,*3P＜0.05

组别大鼠/只剂量/(mg·kg-1) MDA/(mmol·mg-1) SOD/(U·mg-1) MPO/(U·g-1) LTFV组2050.00.97±0.13152.71±20.110.59±0.17 MTFV组20100.00.83±0.17*1169.53±20.17*2*30.46±0.18*1HTFV组20150.00.76±0.14*2*3179.28±21.08*2*30.32±0.12*2*3DXMS组202.00.67±0.14*2175.81±20.18*20.33±0.15*2CLP组200.01.28±0.16107.83±21.160.66±0.19 SHAM组200.00.61±0.19213.33±10.140.29±0.11

2.4 大鼠肺组织细胞凋亡率和NF-κB p65的表达结果 TUNEL检测结果显示,CLP组有较多的阳性细胞,其中细胞棕黄色染色者为阳性细胞。SHAM组有少量的阳性细胞。DXMS组阳性细胞明显减少。而TFV组伴随剂量的增加,阳性细胞的表达也在不断的减少,尤其是HTFV组,阳性细胞表达明显减少。见图1。与CLP组比较,SHAM组、DXMS组、TFV组肺组织细胞凋亡率和NF-κB p65表达均差异有统计学意义(P＜0.05)。其中TFV组伴随剂量的加大,差异性更加明显。TFV组组内比较,HTFV组细胞凋亡率和NF-κBp65表达最低,与LTFV组比较差异有统计学意义(P＜0.05),与MTFV组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

3 讨论

CLP术是诱导脓毒症的经典方案,术后腹腔粪便的漏出产生局部感染灶,细菌大量繁殖和内毒素的释放激发宿主防御反应,诱发全身性炎症反应,产生大量炎症因子,启动炎症级联反应[5]。炎症因子能直接损伤靶器官,肺是脓毒症最易损伤的器官,能通过促进脂质过氧化、中性粒细胞的迁移和活化对肺组织产生损害作用及肺水肿[6]。

表4 6组大鼠肺组织细胞凋亡率和NF-κB p65表达的变化Tab.4 Comparison of cell apoptosis rate and NF-κB p65 expression in lung tissue among six groups of rats ±s

表4 6组大鼠肺组织细胞凋亡率和NF-κB p65表达的变化Tab.4 Comparison of cell apoptosis rate and NF-κB p65 expression in lung tissue among six groups of rats ±s

与CLP组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01;与LTFV组比较,*3P＜0.05Compared with CLP group,*1P＜0.05,*2P＜0.01;compared with LTFV group,*3P＜0.05

组别大鼠/只剂量/(mg·kg-1)凋亡率/% NF-κB p65 LTFV组2050.036.27±1.7843.97±3.75*1MTFV组20100.027.44±1.56*132.53±4.42*1HTFV组20150.010.33±1.28*2*328.27±4.38*2*3DXMS组202.010.23±4.98*227.16±4.48*2CLP组200.041.31±5.2851.47±4.57 SHAM组200.08.58±0.879.63±2.15

ALI是因机体全身性炎症反应导致的器官损伤。其中NF-κB p65是一种转录调节因子,其活性上调可激活MIP-2、ICAM-1、TNF-α等炎性因子的转录调控,使中性粒细胞趋化、粘附、活化[7]。TNF-α的过表达促进MIP-2的分泌,增强白细胞的聚集和中性粒细胞的活化和浸润,促进其他炎症因子的释放,炎症的刺激上调肺部血管内皮细胞ICAM-1的表达,浸润到炎症部位的中性粒细胞增加,组织损伤加重[8]。机体免疫功能紊乱,进一步引发肺组织肺泡上皮细胞的凋亡的发生[9]。本文数据显示,CLP组肺组织MIP-2、ICAM-1、TNF-α水平和NF-κB p65表达以及肺组织上皮细胞凋亡率明显高于假手术组,表明肺部组织产生严重的炎症反应,并引发炎症连锁反应,局部中性粒细胞浸润,炎性渗出以及炎症反应加重,结果BALF中白细胞、蛋白含量和肺组织W/D明显提高。

A.LTFV组;B.MTFV组;C.HTFV组;D.DXMS组;E.CLP组;F.SHAM组图1 6组大鼠肺组织细胞凋亡TUNEL法检测图(×400)A.LTFV group；B.MTFV group；C.HTFV group；D.DXMS group；E.CLP group；F.SHAM groupFig.1 Images of cell apoptosis of lung tissue in six groups of rats by TUNEL method(×400)

ALI常伴随巨噬细胞和中性粒细胞激活和呼吸爆发产生大量的氧自由基,过量自由基可使生物膜中的不饱和脂肪酸过氧化形成脂质过氧化产物MDA[10],MDA产生增加,体内抗氧化的SOD减少,抗氧化能力下降。其中MPO作为中性粒细胞活化的标志酶,其活性的变化反应了中性粒细胞的激活程度[11],SOD作为机体内重要的氧自由基清除剂,具有极强的抗氧化作用,能清除体内超氧阴离子、自由基保护细胞免受损伤[12-13]。

本研究显示,马鞭草总黄酮具有较好的抗氧化作用和抗炎作用,减少中性粒细胞在肺组织中粘附和迁移以及炎性渗出,降低BALF中清蛋白和白细胞含量和肺泡毛细血管膜的高通透性,减少细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子MIP-2表达,抑制中性粒细胞的迁移和白细胞的释放,降低ICAM-1的表达从而达到抑制中性粒细胞与组织的粘附作用,改善肺水肿程度。促进SOD的表达,提高小鼠体内清除自由基的能力,降低脂质代谢产物MDA及MPO等介质的释放。同时马鞭草总黄酮能下调NF-κB p65的表达,减少促炎症因子TNF-α的生成,控制炎症的级联反应,从而达到降低肺组织上皮细胞凋亡率,改善肺组织功能。

综上所述,马鞭草总黄酮能有效降低脓毒性急性肺损伤大鼠的炎症递质水平,减轻脂质过氧化,改善肺泡毛细血管通透性,减轻中性粒细胞浸润及炎性渗出,发挥一定的肺脏保护作用。

[1] 徐昉,杨远征,刘琼.姜黄素对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用及对细胞间粘附分子-1和肿瘤坏死因子-α表达的影响[J].中国生物制品学杂志,2011,24(1):75-78.

[2] 徐笑益,方向明,鲍军明,等.脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡的研究[J].全科医学临床与教育,2007,5 (1):12-13.

[3] 卞杰松,邓斌,王存嫦,等.超声波提取马鞭草中黄酮类化合物的工艺研究[J].时珍国医国药,2009,20(6): 1420-1421.

[4] SINGLETON K D,WISCHMEYER P E.Effects of HSP70. 1/3 gene knockout on acute respiratory distress syndrome and the inflammatory response following sepsis[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2006,290(5):L956-961.

[5] 陈露露,徐关丽,袁红梅,等.龙胆苦苷对脓毒症所致急性肺损伤小鼠的保护作用[J].第三军医大学学报, 2012,34(23):2392-2394.

[6] 赵海金,蔡绍曦.脓毒症致急性肺损伤机制研究进展[J].实用医学杂志,2004,20(9):1084-1086.

[7] 郭振辉,洪新,毛宝龄,等.核因子-κB活化在脓毒症急性肺损伤发病中作用[J].中国危重病急救医学,2000,12 (6):334-337.

[8] 张韧,王丁超,苏秀平,等.扶正败毒颗粒对脓毒症大鼠急性肺损伤保护作用的实验研究[J].中国中医急诊, 2011,20(10):1615-1616.

[9] 韩峻.中心静脉压在连续性血液净化治疗脓毒症护理中的意义[J].护理学杂志,2010,25(23):35-36.

[10] 吴海青,李涛平,黄丽.骨髓间充质干细胞对急性肺损伤大鼠氧化应激的影响[J].临床肺科杂志,2012,17(4): 593-596.

[11] 葛家希,邵东华,王洪.米屈肼预给药对小鼠急性肺损伤的保护作用[J].江苏大学学报:医学版,2012,22(1): 58.

[12] 吴海青,李涛平,黄丽.骨髓间充质干细胞对急性肺损伤大鼠氧化应激的影响[J].临床肺科杂志,2012,17(4): 593-596.

[13] 葛平玉,常青,许灌成.归芪五子方对睾丸损伤模型大鼠精子凋亡以及SOD和MDA与NOS水平的影响[J].医药导报,2013,32(8):993-995.

DOI 10.3870/yydb.2014.04.005

Protection Mechanism of the Total Flavonoids from Verbena on Rats with Septic Acute Lung Injury

SONG Zhao-hua,ZHU Bao-an
(Luohe Medical College,Luohe 462002,China)

Objective To observe the protective effect and mechanism of the total flavonoids ofverbenaon rats with septic acute lung injury(ALI).MethodsA total of 120 rats were randomly divided into sham operation group(0.9% sodium chloride solution),model group(0.9%sodium chloride solution),dexamethasone positive control group (2.0 mg·kg-1,ip),low,middle and high dose of the total flavonoids ofverbenagroup(50.0,100.0,150.0 mg·kg-1,ip). Rat model with ALI was induced by Cecal ligation and puncture(CLP).The rats were injected with physiological saline, dexamethasone,low,middle and high dose of the total flavonoids ofverbena,respectively 24 h after establishment of the ALI model,and executed 48 h later.Bronchoalveolar lavage fluid(BALF)changes in leukocyte,protein content and the lung tissue wet to dry weight ratio(W/D)were observed,and the levels of inflammatory mediators,oxidation stress and nuclear transcription factor(NF-κB)p65 expression and cell apoptosis in lung tissue were compared.ResultsTotal flavonoids ofverbenasignificantly decreased leukocytes,protein content and W/D in BALF(P＜0.05 orP＜0.01),decreased microphage inflammation protein-2(MIP-2),intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1),tumor necrosis factor-α(TNF-α)and apoptotic rate of lung cells and expression of NF-κB p65(P＜0.05 orP＜0.01),and improved MDA content,activity of superoxide dismutase(SOD)and myeloperoxidase(MPO)(P＜0.05 orP＜0.01).The effects were the greatest in the high dose group(P＜0.01).ConclusionThe total flavone ofverbenacan reduce the levels of inflammatory mediators,reduce lipid peroxidation, improve the alveolar capillary permeability,and alleviate the occurrence and development of ALI.

Total flavonoids fromverbena;Injury,lung,acute;Septic;Protection mechanism

R282.71;R285.5

A

1004-0781(2014)04-0429-05

2013-03-25

2013-10-08

宋兆华(1981-),男,河南漯河人,讲师,硕士,从事人体解剖学教学与研究。电话:(0)13938013804,E-mail：szhualh@163.com。