氧化苦参碱对肝硬化大鼠肠源性内毒素血症的影响

朱方擎，陈卫国，陈杰，林浩，刘立玺，龚敏，文萍，文剑波

(南方医科大学附属萍乡医院 1.消化内科；2.药学部，萍乡 337000)

氧化苦参碱对肝硬化大鼠肠源性内毒素血症的影响

朱方擎1，陈卫国1，陈杰2，林浩1，刘立玺1，龚敏1，文萍1，文剑波1

(南方医科大学附属萍乡医院 1.消化内科；2.药学部，萍乡 337000)

目的 探究氧化苦参碱对肝硬化大鼠肠源性内毒素血症的影响。方法使用四氯化碳(CCl4)进行肝硬化大鼠模型制备,30只制备成功的肝硬化大鼠随机分成两组:治疗组接受氧化苦参碱肌内注射(63 mg·kg-1);模型组接受同等剂量5%葡萄糖溶液肌内注射。另取10只健康大鼠作为正常组。实验结束后,取大鼠门静脉血,使用鲎试剂盒,运用动态浊度法对血浆样品进行内毒素检测;取末段回肠组织,用ELISA试剂盒进行肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)浓度的测定,并进行光学显微镜下回肠组织病理学观察。结果模型组内毒素水平明显高于正常组,氧化苦参碱治疗后,治疗组内毒素水平明显下降,与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较,治疗组回肠组织中TNF-α和IL-6的浓度显著下降(P＜0.01)。模型组大鼠肠黏膜绒毛萎缩、脱落、断裂,黏膜固有层甚至肌层可见炎细胞浸润,绒毛水肿严重,并可见肌层组织水肿疏松;治疗组肠黏膜得到修复,绒毛整齐,水肿减轻,黏膜层致密,浸润的炎细胞明显减少。结论氧化苦参碱能降低肝硬化大鼠肠黏膜组织细胞因子TNF-α、IL-6的浓度水平,改善肠黏膜屏障功能,从而减轻肠源性内毒素血症。

氧化苦参碱；肝硬化；内毒素血症；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-6

肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病,由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。早期由于肝脏代偿功能较强可无明显症状,后期则以肝功能损害和门静脉高压为主要表现,并有多系统受累,晚期常出现上消化道出血、肝性脑病、继发感染、腹腔积液、肝肾综合征等并发症。研究证实,肠源性内毒素血症与肝硬化上述并发症的发生关系密切[1]。大多数肝硬化患者可出现肠黏膜屏障功能损伤,使得肠源性内毒素透过肠黏膜屏障进入血液循环,形成肠源性内毒素血症[2]。因此,寻找有效的治疗方法来减轻肝硬化患者的内毒素血症日益受到重视。氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)是传统中药草本苦参中的提取物,有多种药理作用,抗炎作用是其最重要的药理作用之一[3]。研究表明,OMT能抑制各种大鼠模型中细胞因子释放[3-5]。因此,笔者假设OMT能通过抗炎作用保护肠黏膜屏障功能,从而减轻肠源性内毒素血症。因而,笔者探讨OMT在肝硬化肠源性内毒素血症中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 50只SPF级雄性SD大鼠(合格证号: 4304701345),体质量180～220 g,购自上海斯莱克实验动物有限公司。实验动物生产许可证:SCXK(沪)2003-0003；实验动物使用许可证:SYXK(苏)2002-0123。四氯化碳(CCl4)溶液和医用橄榄油购自上海国药集团化学试剂有限公司；内毒素检测鲎试剂盒(批号:130308)购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司；大鼠肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)ELISA检测试剂盒(批号: E02T0008、E02I0006)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；苦参素注射液(批号:130312102)由江苏正大天晴药业集团股份有限公司提供,规格:2 mL∶0.6 g。

1.2 造模、分组、药物注射 取40只正常大鼠进行肝硬化造模,采用40%CCl4橄榄油溶液(按2∶3比例配置)0.3 mL·kg-1,皮下注射,每周2次,按个体化原则,每只大鼠根据自身体质量调整剂量,共12周[6]。最后制成肝硬化大鼠共30只,肝脏病理图片见图1。另取10只正常大鼠标记为正常组(n=10)。造模成功大鼠分为模型组(n=15)和治疗组(n=15)。治疗组大鼠接受5%葡萄糖溶液配置的OMT肌内注射(63 mg·kg-1)共4周,qd；正常组和模型组大鼠分别肌内注射同等剂量5%葡萄糖溶液4周,qd。与此同时,模型组与治疗组大鼠继续接受40%CCl4橄榄油溶液皮下注射至16周。16周实验周期结束后,所有大鼠使用3%水合氯醛进行麻醉并解剖。收集门静脉血样品进行保存,并取末段回肠组织存储于液氮罐中备用。

图1 大鼠肝脏HE染色病理图片(A.×40;B.×200)Fig.1 Hematoxylin and eosin staining of liver tissue (A.×40；B.×200)

1.3 血浆内毒素水平测定 使用内毒素检测鲎试剂盒,运用动态浊度法对血浆样品进行内毒素检测。采集2 mL以上的静脉血3 000 r·min-1离心60 s。取0.1 mL样本上清液,加入0.9 mL样本处理液中,混匀后70℃加热10 min,之后立即冰浴3 min。取0.2 mL样本混合液加入鲎试剂中,混匀后移取0.1 mL至96微孔板中上机检测。

1.4 检测回肠组织中TNF-α和IL-6的浓度 采用ELISA的方法检测回肠组织中TNF-α和IL-6的浓度。将冰冻保存的回肠组织剪成碎片,加入预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)液中并进行匀浆,然后用离心机5 000 r·min-1离心15 min,取上清液作为待测标本。TNF-α和IL-6浓度检测严格按照试剂盒说明书进行操作,并根据检测结果作出标准曲线,计算出标本浓度。

1.5 回肠组织病理学观察 对末段回肠组织样品进行常规组织病理学观察。使用0.9%氯化钠溶液清洗回肠组织,然后用10%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜下对黏膜损伤程度进行评估,观察绒毛排列是否整齐,黏膜有无水肿及炎细胞浸润程度等。

1.6 统计学方法 用SPSS16.0版统计学软件进行分析,数据以均数±标准差(±s)表示。TNF-α和IL-6数据为计量资料,组间比较示方差齐,行单因素方差分析,均数间多重比较采用SNK检验(Student-Newman-Keuls)；血浆内毒素数据为等级资料,使用秩转换非参数统计方法中的H检验法(Kruskal-Wallis H test)进行比较,组间两两比较使用Nemenyi检验法,以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆内毒素水平 见表1。模型组的内毒素水平明显高于正常组,组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)。模型组中有13只大鼠内毒素水平＞0.035 EU·mL-1,而治疗组中仅为7只,OMT治疗后,治疗组内毒素水平显著下降,与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

表1 3组大鼠血浆内毒素水平比较Tab.1 Comparison of the serum endotoxin levels among three groups of rats 只

2.2 回肠组织中TNF-α和IL-6浓度水平 与正常组比较,模型组TNF-α和IL-6浓度水平明显升高(P＜0.01)。OMT治疗后,治疗组TNF-α和IL-6浓度水平显著下降,与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01),见表2。

表2 3组大鼠回肠组织中TNF-α和IL-6浓度比较Tab.2 Comparison of TNF-α and IL-6 levels in ileal tissue among three groups of rats pg·mL-1,±s

表2 3组大鼠回肠组织中TNF-α和IL-6浓度比较Tab.2 Comparison of TNF-α and IL-6 levels in ileal tissue among three groups of rats pg·mL-1,±s

与模型组比较,*1P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.01

组别大鼠/只TNF-αIL-6治疗组1597.83±17.79*178.07±24.94*1模型组15152.52±15.81118.82±35.71正常组1048.63±18.73*150.88±22.13*1

2.3 回肠组织病理学改变 正常组肠壁组织黏膜完整,绒毛排列整齐,肠黏膜仅有少量炎细胞浸润(图 2A)。模型组大鼠肠黏膜可见绒毛萎缩、变短、断裂,并可见大量炎细胞浸润于黏膜固有层甚至肌层；另外,可见绒毛严重水肿,黏膜层组织疏松(图2B)。经过OMT治疗后,治疗组大鼠肠黏膜绒毛整齐,水肿减轻,黏膜层更致密,浸润的炎细胞明显减少(图2C)。

3 讨论

研究证实,OMT能抑制各种大鼠模型细胞因子释放,包括创伤性脑损伤、葡聚糖硫酸盐钠诱导结肠炎、肠道缺血-再灌注损伤和急性胰腺炎等模型[3-5]。虽然OMT有抗炎治疗效果,但笔者未见OMT减少肝硬化大鼠肠黏膜中细胞因子的研究。本实验中,笔者假设OMT能够减少肝硬化大鼠肠道组织中TNF-α和IL-6发挥其抗炎作用,从而改善肠黏膜屏障功能,减轻肠源性内毒素血症。

A.正常组;B.模型组;C.治疗组图2 大鼠回肠病理切片(HE,×200)A.control group；B.model group；C.treatment groupFig.2 Hematoxylin and eosin staining of ileal tissue(HE,×200)

肝硬化肠黏膜屏障功能损伤的确切机制尚未阐明,但细胞因子在损伤中起了至关重要作用。在大量促炎递质中,TNF-α在肠屏障功能的生理调节中起重要作用[7-8]。此外,TNF-α可能是诱导诸如IL-6、IFN-γ等多种细胞因子产生的递质,而这些细胞因子将加重肠屏障损伤。YANG等[6]研究结果证实了丹参多酚酸盐通过抑制TNF-α和IL-6 mRNA的表达修复了肝硬化大鼠肠黏膜的损伤。这表明TNF-α在肠黏膜屏障功能的损害中起了重要作用。除此之外,IL-6也是肠黏膜屏障损害的重要炎症因子。DU PLESSIS等[9]的研究表明,肝硬化时肠道巨噬细胞呈激活表型,将引起iNOS表达和NO、IL-6分泌,从而破坏肠黏膜屏障功能。近来,有研究表明,IL-6能改变培养的肠上皮细胞紧密连接蛋白Claudin-2的表达和肠道通透性,这阐明了肠道局部炎症和肠道通透性的确切关联[10]。因此, TNF-α和IL-6是肝硬化肠黏膜屏障损伤中的重要炎症因子。本实验中,笔者观察到模型组肠道组织中TNF-α、IL-6浓度水平明显提高,肠黏膜屏障功能损害严重,肠源性内毒素血症严重；经过OMT治疗后,TNF-α、IL-6浓度水平显著下降,肠黏膜屏障功能得到改善,肠源性内毒素血症减轻。

总之,OMT通过降低肠黏膜细胞因子TNF-α、IL-6的浓度水平,改善肠黏膜屏障功能,从而减轻肠源性内毒素血症。此外,OMT可能具有对肠道内毒素的直接清除作用,从而减少肠源性内毒素血症的发生。当然, OMT减轻肠源性内毒素血症的确切机制有待进一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.04.007

Effect of Oxymatrine on Enterogenous Endotoxemia in Cirrhotic Rats

ZHU Fang-qing1,CHEN Wei-guo1,CHEN Jie2,LIN Hao1,LIU Li-xi1,GONG Min1,WEN Ping1,WEN Jian-bo1
(1.Department of Gastroenterology;2.Department of Pharmacy,The Affiliated Pingχiang Hospital of Southern Medical University,Pingχiang 337000,China)

Objective To investigate the effect of oxymatrine on enterogenous endotoxemia in rats with cirrhosis.MethodsThirty rats with carbon tetrachloride(CCl4)-induced cirrhosis were randomly divided into two groups:the treatment group,who received oxymatrine intramuscular injection(63 mg·kg-1);and the model control group,who received the same volume of 5%glucose solution.Another 10 healthy rats served as the normal control group.At the end of the experiment,serum samples were taken from the portal vein for the detection of endotoxin level with a Kinetic Turbidimetric Limulus Amebocyte Lysate Kit.Concentration of TNF-α and IL-6 in the ileum tissue was analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). A piece of terminal ileum was also sampled for histopathologic examination.ResultsThe serum endotoxin level was significantly elevated in the model control group than the normal control group.After the treatment with oxymatrine,the serum endotoxin level was significantly decreased compared with the model control(P＜0.01).Administration of oxymatrine resulted in a significant reduction in the concentration of TNF-α and IL-6 compared with the model control group(P＜0.01).The intestinal mucosal villi in rats of the model control group were atrophic,shorter,fractured,and infiltrated with inflammatory cells into the lamina propria and even muscular layer.The swelling of the villi was serious and structure of mucous membrane became loose. This observation was reversed in the treatment group.ConclusionOxymatrine decreased enterogenous endotoxemia in cirrhotic rats by reducing the concentration of TNF-α and IL-6 and improving intestinal barrier function.

Oxymatrine;Cirrhosis;Endotoxemia;Tumor necrosis factor-α;Interleukin-6

R287;R285.5

A

1004-0781(2014)04-0438-04

2013-10-15

2014-01-20

朱方擎(1989-),男,江西赣州人,在读硕士,研究方向:肝硬化肠黏膜屏障功能。电话:0799-6881797,E-mail：195375529@qq.com。

文剑波(1963-),男,江西萍乡人,硕士生导师,研究方向:肠黏膜屏障功能。电话:0799-6881797,E-mail：wenjbpx@126.com。