荧光淬灭法研究热敏脂质体的体外释放行为*

陆媛媛，符旭东，胡戴，赵倩，李雪梅

(1.广州军区武汉总医院药剂科，武汉 430070；2.湖北中医药大学药学院，武汉 430065)

荧光淬灭法研究热敏脂质体的体外释放行为*

陆媛媛1，2，符旭东1，胡戴1，2，赵倩1，2，李雪梅1，2

(1.广州军区武汉总医院药剂科，武汉 430070；2.湖北中医药大学药学院，武汉 430065)

目的 建立一种简单且精确评价热敏脂质体(TSL)体外释放行为的方法。方法采用薄膜分散法制备钙黄绿素热敏脂质体(CTSL),利用荧光自淬灭法研究热敏脂质体的体外释放,通过差示扫描量热法测定热敏脂质体的相变温度。结果制备热敏脂质体能成功包裹高浓度荧光素,被包裹的钙黄绿素能屏蔽自身的发射光。钙黄绿素在0.000 1～0.001 mmol·L-1浓度范围内,荧光强度与浓度之间存在良好的线性关系。CTSL在37和41℃下10 min的释放度分别为0.1%和45.4%。CTSL的相转变温度约为41℃。结论通过荧光淬灭法研究评价热敏脂质体的热敏释药特性,方法准确、简单、可行。

钙黄绿素；脂质体,热敏；荧光淬灭

热敏脂质体(thermosensitive liposome,TSL)是一种新型的药物载体,能结合热疗靶向将药物输送到实体瘤部位。在人正常体温时,药物在血液循环中能安全地包封在TSL中而不被释放。而当循环到加热的肿瘤部位时,由于TSL的双层膜的渗透性改变,导致药物的释放[1]。传统的测量热敏脂质体的释放行为的方法往往是先利用透析袋分离脂质体和游离药物,再测定释放度[2]。由于药物扩散速度会影响药物透过透析袋的时间,而热敏脂质体的释放往往表现出突释特征[1],所以透析袋测定方法往往不能真实反映热敏脂质体的释药特征,并且这种方法复杂且操作繁琐。本实验旨在建立一种简单且精确的方法研究热敏脂质体的体外释放行为。钙黄绿素是一种常见的荧光素,溶于水后呈黄绿色荧光。当其浓度大于100 mmol·L-1时,稳定且具有荧光自淬灭的性质,仅能检测到微弱的背景信号。TSL在温度高于相变温度时,脂质体的稳定性被破坏,膜的通透性增强,钙黄绿素泄露出来。浓度逐渐稀释,荧光自淬灭现象减弱,荧光信号增强。笔者利用热敏脂质体包裹高浓度钙黄绿素,通过荧光光度法测定其释放曲线,并将其测定结果与热敏脂质体示差扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)测定结果进行比较,以此评价荧光分光光度法测定热敏脂质体的体外释放行为的可行性[3]。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 单棕榈酰磷脂酰胆碱(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine,MPPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC)、二硬脂酸磷脂酞胆碱[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol),DSPC]、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-PEG-NHS,DSPE-PEG-NHS)均购于美国Avanti polar lipids公司,批号:229088；钙黄绿素(国药集团化学试剂有限公司,批号:20120305)；曲拉通(triton X-100)；葡聚糖凝胶G-50(Pharmacia公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器 荧光分光光度计(日本日立公司,型号:OA1801P F-2700)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂,型号:RE-52A)；透析袋(BIOSHARP公司,截留相对分子质量为8 000～14 000)；紫外分光光度计(日本岛津公司,型号:UV-2800AH)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司,型号:JY92-2D),电子天平(AB204-IU)。

1.3 钙黄绿素热敏脂质体(calcein thermosensitive liposome,CTSL)的制备及纯化 精密称取钙黄绿素0.6 g溶于磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saling, PBS,pH=7.4)5 mL中。用4 mol·L-1氢氧化钠(NaOH)调pH到7.4,用PBS定容到10 mL即得终浓度为100 mmol·L-1的钙黄绿素溶液。保存备用。

取磷脂材料(DPPC,DSPC,MPPC,DSPE-PEG-NHS质量比为9∶1∶0.8∶0.5)溶于7 mL三氯甲烷中,置于250 mL圆底烧瓶中,在旋转蒸发仪中于40℃水浴下减压旋转45 min,以彻底挥去有机溶剂。于真空干燥器中放置12 h,再用100 mmol·L-1钙黄绿素溶液于60℃水化,探针超声6 min后分别过0.45,0.22 mm的聚碳酸醋膜各3次,即得CTSL。

精密吸取CTSL0.1 mL于葡聚糖凝胶G-50柱,用PBS缓冲液洗脱,流速1 mL·min-1,接收洗脱液,每管0.2 mL,依次编号。用紫外分光光度计于496 nm处测量每管吸光度,绘制洗脱曲线。

1.4 释放液中钙黄绿素含量测定的方法学考查

1.4.1 专属性实验 将相同浓度的钙黄绿素溶液和空白热敏脂质体,设定激发光波长为490 nm,在荧光分光光度计中进行扫描,测定磷脂对钙黄绿素的测定有无干扰。

1.4.2 标准曲线的绘制 精密称取钙黄绿素0.012 5 g,用PBS溶液配制浓度为0.01 mmol·L-1的钙黄绿素溶液,再分别精密吸取0.1,0.2,0.3,0.5, 0.8,1 mL于10 mL量瓶中定容。在激发波长490 nm,发射波长515 nm条件下分别测其荧光值,绘制标准曲线。

1.4.3 加样回收率实验 取CTSL 1.0 mL置10 mL量瓶中,分别加入0.000 1,0.000 5,0.001 mmol·L-1钙黄绿素对照品溶液1.0 mL,加PBS稀释至刻度,摇匀,于荧光分光光度计在激发波长490 nm,发射波长515 nm条件下分别测其荧光值,每份平行重复3次,以吸光度值按外标一点法计算回收率。

1.4.4 钙黄绿素溶液的稳定性 精密配制浓度为0.000 1,0.000 5,0.001 mmol·L-1钙黄绿素溶液,分别在1,2,5,12 h测量其荧光值。

1.5 CTSL体外释放度的测定

1.5.1 不同温度释放度的测定 精密吸取纯化后的CTSL 1 mL,加入50 mL PBS中,分别在不同温度下磁力搅拌。于0,10 min精密取样0.2 mL,用PBS稀释到2 mL,测定荧光值,分别作为初始荧光值(I0)和不同时刻的荧光值(It)；另精密吸取1 mL纯化后的CTSL加入10 μL 1%triton X-100,摇匀后用PBS稀释到500 mL,测定荧光值,作为脂质体中钙黄绿素全部释放的荧光值(I∞)。按照以下公式计算钙黄绿素的释放度:释放度(%)=(It-I0)/(I∞-I0)×100%。

1.5.2 荧光淬灭法测量CTSL的体外释放 按照“1.5.1”项下方法,在43℃磁力搅拌。于1,5,10,20, 40,60 min取样测定,计算钙黄绿素的累积释放度。

1.5.3 透析法测量CTSL体外释放曲线 取纯化后的CTSL溶液1 mL加入透析袋内,两端夹紧后,放入50 mLPBS溶液中,在43℃条件下磁力搅拌。分别在1,5,10,20,40,60 min取出1 mL透析液,同时补充相同体积的释放介质。另取CTSL溶液1 mL加入50 mL PBS破乳摇匀后,采用紫外分光光度计测定,计算钙黄绿素的释放度。释放百分度的公式为:F=At/A0× 100%(其中F为释放度,At为累计释放的钙黄绿素的量,A0为加人透析袋中钙黄绿素的总量)。

1.6 DSC测定CTSL的相变温度 用微量注射器将脂质体样品逐滴加入铝制DSC坩埚,用镊子将铝盖放置到坩埚上,密封。将坩埚放入仪器,充氮气。在20～60℃内以5℃·min-1运行扫描,采集数据。

2 结果

2.1 CTSL的纯化 以荧光值(F)为纵坐标,试管编号(n)为横坐标绘制洗脱曲线,由图1可知,在第19到21号试管时,没有紫外吸收。说明热敏脂质体和游离药物可以被分离。收集前4 mL洗脱液即为钙黄绿素热敏脂质体。见图1。

图1 CTSL洗脱曲线Fig.1 Elution curve of CTSL

2.2 释放液中钙黄绿素含量测定的方法学考察 测量结果得出,钙黄绿素在激发光为490 nm时,最大荧光强度发射光波长为515 nm,而此波长下磷脂无荧光吸收,故磷脂对钙黄绿素含量测定无影响。以荧光值(F)为纵坐标,钙黄绿素浓度(C)为横坐标绘制标准曲线,得线性回归方程为F=545.89C-194.18,R2=0.999 5,可见钙黄绿素在0.000 1～0.001 mmol·L-1浓度范围内有良好的线性关系。高、中、低3种浓度的平均加样回收率为100.6%,RSD=1.1%(n=9),回收率符合分析方法的要求。浓度0.000 1,0.000 5,0.001 mmol·L-1钙黄绿素溶液,12 h内测量的荧光值RSD＜2.0%,说明钙黄绿素溶液在12 h内能保持稳定。

2.3 CTSL不同温度释放度 以释放度(F)为纵坐标,温度(T)为横坐标绘制曲线。结果显示,随着温度升高,释放量逐渐增加。37～40℃时几乎没有释放。41℃时,突然大量释放。所以41℃约为此热敏脂质体的相变温度。见图2。

2.4 两种方法测定CTSL体外释放度的比较 以释放度(F)为纵坐标,时间(t)为横坐标分别绘制以两种方法测量的CTSL在43℃的释放曲线。结果显示: CTSL在相变温度下能实现完全的释放,并且在相变温度的释放速度非常快,20 min内释放可达80%。而在37℃时基本不释放。透析袋法和荧光淬灭法均能用于CTSL的体外释放,荧光淬灭法因为避免了荧光素与脂质体的分离过程,释放速度略快于透析袋法,结果更加准确,更能代表CTSL的体外释放结果。见图3。

图2 CTSL在不同温度的释放度(n=3)Fig.2 Release rate of CTSL at different temperature(n=3)

图3 CTSL在41℃时释放曲线(n=3)Fig.3 Releasing curve of CTSL at 41℃(n=3)

2.5 DSC测定CTSL的相变温度结果 结果显示:空白热敏脂质体的相变温度为40.805℃,CTSL的相变温度为40.842℃。说明钙黄绿素对于热敏脂质体的相变温度的测量没有影响。DSC的结果和荧光淬灭法测量的结果基本吻合,说明可以通过荧光淬灭法准确的测量热敏脂质体的体外释放行为,也说明了采用释放行为确定相变温度的合理性。见图4。

3 讨论

利用热敏脂质体包裹高浓度荧光素的自淬灭效应,荧光信号微弱。TSL在温度高于相变温度时,膜的通透性增强,钙黄绿素泄露并稀释,荧光信号增强。这种测定方法不受药物扩散速度影响,可以不经分离直接测定释放度,方法简便快捷。如今热敏脂质体的相变温度主要是借助高灵敏度的DSC来测量,价格昂贵且对磷脂浓度要求较高。本实验结果表明DSC的结果和荧光淬灭法测量的结果基本吻合,可以借助测量钙黄绿素的释放行为测量脂质体的相变温度。

热敏脂质体释放行为的改变往往会受到加入药物的影响,比如加入含二丙酸倍氯米松(BDP)的DPPC脂质体的预相变温度显著下降。本实验结果表明,加入钙黄绿素后,DSC测定的DPPC脂质体的相变温度基本相同,说明钙黄绿素的加入对脂质体的相变温度没有影响。同时也证明了利用钙黄绿素测定脂质体释放行为的合理性。

A.空白热敏脂质体;B.CTSL图4 CTSL的相变温度示差扫描量热图A.the blank TSL；B.CTSLFig.4 Transformation temperature graph of CTSL by differential scanning calorimetry

[1] DE SMET M,LANGEREIS S,VANDEN BOSCH S,et al. Temperaturesensitiveliposomesfordoxorubicindelivery under MRI guidance[J].J Controlled Rel,2010,143(1): 120-127.

[2] STRIETH S,EICHHOM M E,WERNER A,et al.Paclitaxel encapsulatedincationicliposomesincreasestumor microvessel leakiness and improves therapeutic efficacy in combination with Cisplatin[J].Clin Cancer Res,2008,14 (14):4603-4611.

[3] HOSSANN M,SYUNYAEVA Z,SCHMIDT R,et al.Proteins and cholesterol lipid vesicles are mediators of drug release from thermosensitive liposomes[J].J Controlled Rel,2012, 162(2):400-406.

DOI 10.3870/yydb.2014.04.021

Establishment of a Method for Evaluating the Release Behavior of Thermo Sensitive Liposome in vitro

LU Yuan-yuan1,2,FU Xu-dong1,HU Dai1,2,ZHAO Qian1,2,LI Xue-mei1,2
(1.Department of Pharmacy, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Area,Wuhan 430070,China;2.College of Pharmacy,Hubei College of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

Objective To establish a simple and accurate method to evaluate the release behavior of thermo sensitive liposome(TSL).MethodsCalcein thermo sensitive liposome(CTSL)was prepared by film hydration method,and the release behavior was measured by fluorescence quenching method.Then the transformation temperture was verified by differential scanning calorimetry.ResultsThermo sensitive liposome with different phospholipids could encapsulate the high concentration of calcein successfully,and trapped calcein could shield its emitted light.Calcein was in a good linearity among the concentrations of 10-4～10-3mmol·L-1.The 10-min release rate at 37 and 41℃were 0.1%and 45.4%,respectively.The transformation temperature of CTSL was 41℃.ConclusionThe simple and accurate method to evaluate thermo sensitive liposome release behavior is successfully established based on fluorescence quenching method.

Calcein;Thermosensitive liposomes;Fluorescent quenching

R944.9;R927.1

A

1004-0781(2014)04-0484-04

2013-08-19

2013-09-24

*2011年湖北省科技计划自然科学基金资助项目(2011CDB019)

陆媛媛(1986-),女,湖北荆州人,在读硕士,研究方向:靶向给药新剂型。电话:(0)15972124957,E-mail：lyy_201209@163.com。

符旭东(1969-),女,湖北武汉人,硕士生导师,主任药师,博士,研究方向:靶向给药新剂型。电话:027-68878610,E-mail：fuxudong2013@163.com。