响应面法优化陕西产重楼多糖提取工艺*

刘芸,赵鹏,宋逍,王昌利

(1.陕西中医学院附属医院药剂科,咸阳 712046；2.陕西中医学院药学院,咸阳 712046)

·药物制剂与药品质量控制·

响应面法优化陕西产重楼多糖提取工艺*

刘芸1,赵鹏2,宋逍2,王昌利2

(1.陕西中医学院附属医院药剂科,咸阳 712046；2.陕西中医学院药学院,咸阳 712046)

目的 优化陕西产重楼多糖的提取工艺和条件。方法采用单因素实验,以陕西产重楼多糖提取率为评价指标,通过响应面分析方法确定陕西产重楼多糖最佳提取工艺和条件。结果陕西产重楼多糖最佳工艺条件:提取温度92℃,提取时间2.6 h,液料比15(mL∶g),平均提取率为3.22%。结论优化的陕西产重楼多糖提取工艺条件可行。

重楼,陕西产;多糖;响应面优化法;提取

陕西产重楼是百合科植物七叶一枝花[Paris polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara]的干燥根茎[1],又名金线重楼、螺蛳七、七叶一枝花等,是著名的“太白七药”之一。陕西产重楼具有清热解毒、消肿镇痛等功效,现代药理研究表明其具有抗肿瘤、止咳平喘、止血等作用[2-3]。目前对于重楼的活性成分研究主要集中在皂苷、黄酮、植物甾醇等方面[4-7],鉴于多糖是中药材中普遍存在的活性成分之一,具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗衰老等药理作用[8],在保健食品和医疗药品开发方面具有广阔的前景。有关陕西产重楼多糖的提取工艺研究笔者尚未见报道,故应用响应面优化法对陕西产重楼多糖的提取工艺进行了优化研究。

1 材料与仪器

1.1 材料 重楼购自西安市万寿路中药材批发市场,产地为陕西省宝鸡市眉县,经陕西中医学院宋逍副教授鉴定为百合科植物七叶一枝花[Paris polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara]的干燥根茎。实验用葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院,批号: 110833-200503)、无水乙醇、硫酸、苯酚均为分析纯。

1.2 仪器 电子天平(梅特勒-托利多有限责任公司)；EYELA旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)。

2 方法与结果

2.1 陕西产重楼多糖提取工艺流程 见图1所示,将干燥的陕西产重楼粉碎,过孔径0.250 mm(60目)筛。用无水乙醇对重楼颗粒进行脱脂处理,脱脂后的重楼按照一定的料液比加水,加热浸提2次,过滤,滤液按生药体积比1∶1浓缩,浓缩液加无水乙醇至终浓度为80%,静置过夜后抽滤,真空干燥滤饼,可得陕西产重楼粗多糖。

2.2 重楼多糖含量与提取率 多糖含量的测定按照文献[9]报道的苯酚-硫酸法并稍作调整,精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品10 mg,置100 mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得葡萄糖对照品溶液。准确量取上述对照品溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL,分别置10 mL量瓶中,再分别取0.5 mL置试管中,加浓硫酸5 mL和5%苯酚1 mL,在波长490 nm处测定吸光度(A值),进行线性回归,标准曲线为:A=0.010 3C+0.000 4,r=0.999 1,浓度线性范围为0～50 μg·mL-1。

多糖提取率的计算用下式:

2.3 陕西产重楼多糖提取工艺条件优化实验 利用Box-Behnken响应面法,对重楼多糖的提取工艺进行优化研究。在单因素的基础上,确定提取次数为2次,以多糖提取率为指标,对多糖的提取温度、液料比及提取时间进行优化研究,确定陕西产重楼多糖的最优提取工艺条件。实验因素和水平设计见表1。

表1 实验因素水平表Tab.1 Factors and levels of the experiment

2.4 响应面优化实验结果与多糖提取率预测方程对陕西产重楼多糖的提取先进行了单因素实验,分别考察了提取温度、提取时间、液料比及提取次数对陕西产重楼多糖提取率的影响。结果表明,提取温度、时间及液料比均对提取率有显著影响,而提取次数影响不显著,因此对上述3个有显著影响的因素按照表1的设计方案,用Box-Behnken响应面法进行优化实验,总计有17组实验方案组合,其中的12组是析因实验,5组是中心点实验,用来评估整个优化实验出现的误差。结果见表2,3。

表2 Box-Behnken优化实验设计方案与结果Tab.2 Optimization and results of Box-Behnken

采用Design-Expert 7.01版软件对响应面优化实验得到的结果进行研究,结果见表3,按照各因素对实验结果的影响进行二次方程拟合,得到下式:

由表3的分析结果可以看出,回归方程的F值为168.92,其显著水平远远低于0.05,说明利用响应面法拟合得到的实验模型显著性高,按照拟合模型得到的回归方程,考察其因变量与自变量之间的线性相关系数后发现,r=16.91/16.93=0.998 8,表明用该数学模型来评估各相关因素对重楼多糖的提取率的影响比较真实可靠。从表3的方差分析结果可以看出,响应面治疗组合的各单因素中对重楼多糖提取率的结果均有显著影响,对其影响最大的是提取温度,其次为提取时间,液料比无明显的影响。

2.2 等高线图和响应面图分析 通过响应面优化实验分析可以得到相应的响应面图。响应面图可以直观地反映各单因素对重楼多糖提取率的影响以及各单因素之间交互影响的强弱关系。实验结果见响应面曲面图及等高线图2～4。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

图2 时间与液料比对多糖提取率的交互影响Fig.2 Interation of time and ratio of water to material on polysaccharide yeild

图3 时间与温度对多糖提取率的交互影响Fig.3 Interation of time and temperature on polysaccharide yeild

图4 液料比与温度对多糖提取率的交互影响Fig.4 Interation of ratio of water to material and temperature on polysaccharide yeild

从图2～4可以直观地看出:温度对陕西产重楼多糖提取率的影响最大,其描绘得到的曲线较为陡峭；其次是提取时间的影响,其曲线相对于温度而言,相对平滑一些；影响最小的是液料比,其曲线平滑,反映出的数值变化不大。对回归方程求一阶导数[10-11],计算得到X1=0.22,X2=0.13,X3=0.49。按照回归模型预测的热水浸提法提取陕西产重楼多糖的最优工艺条件是提取温度为92.2℃,提取时间为2.57 h,液料比为14.98(mL∶g),在此工艺条件下,预测提取得到陕西产重楼多糖提取率为3.26%。根据实验结果从实际工艺操作方便考虑,微调提取的最佳工艺条件为提取温度为92℃,提取时间为2.6 h,液料比为15 (mL∶g),在此工艺条件下重复操作3次,陕西产重楼多糖的平均提取率为3.22%,实验值与预测值基本相符。

3 讨论

采用Box-Behnken响应面法对陕西产重楼多糖的提取工艺进行了优化研究,得到了和实验结果拟和程度较高的数学模型和较优的陕西产重楼多糖提取工艺条件。研究结果对陕西产重楼多糖提取工艺的放大研究、多糖分离纯化以及结构解析、药理实验等研究,均具有一定的参考价值。

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[2] 李世全.秦岭巴山天然植物志[M].西安:陕西科学技术出版社,1987:353-354.

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[5] 刘贵洲,颜永刚,刘静,等.陕西产重楼生药学研究[J].辽宁中医药大学学报,2011,13(10):94-96.

[6] 王英锋,罗立华,申严,等.HPLC-MASS法测定乳汁中宫血宁胶囊主要有效成分重楼皂苷[J].中国临床药理学杂志,2003,19(5):370-372.

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DOI 10.3870/yydb.2014.09.028

Optimization for Extracting Polysaccharide from Paris polyphylla Smith var.chinensis (Franch.)Hara in Shaan'xi by Response Surface Method

LIU Yun1,ZHAO Peng2,SONG Xiao2,WANG Chang-li2
(1.Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Shanχi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712046,China;2.School of Pharmacy,Shan'Xi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712046,China)

Objective To select the optimum extracting method of polysaccharide fromParis polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara in Shaan'xi.MethodsThe optimum extraction technology and condition were determined by using response surface methodology and single factor experiment,with the extraction ratio of polysaccharides fromParis polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara in Shaan'xi as indicator.ResultsThe optimum extraction condition for the polysaccharides was as follows:extracting at 92℃for 2.6 h and with the liquid to solid ratio of 15(mL∶g).The average extraction yield of polysaccharide was 3.22%under the optimum extraction condition.ConclusionThe method is suitable for the extraction and determination of polysaccharides fromParis polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara in Shaan'xi.

Paris polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara in Shaan'xi;Polysaccharides;Response surface methodology optimization;Extraction

R282.71；TQ460.6

B

1004-0781(2014)09-1212-04

2013-11-12

2014-01-07

*陕西省教育厅重点实验室资助项目(09JS014)

刘芸(1966-),女,陕西咸阳人,主管药师,研究方向为天然药物分离纯化及制剂工艺。电话:(0) 13809142465。

赵鹏(1977-),男,山西临猗人,副教授,博士,研究方向为天然药物分离纯化、修饰及制剂工艺研究。电话: (0)15619526266,E-mail:zhaopeng65@sina.com。