环氧酶-2在骨形态蛋白9诱导间充质干细胞骨向分化中的作用研究

黄 军，刘映孜，袁霜雪，伍秋香，王东旭，周岐新，何百成

（1.重庆医科大学药理学教研室，2.重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆 400016）

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）具有定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及肌细胞的能力。MSCs是再生领域中一种理想的种子细胞，在临床治疗骨缺损及骨不连接等疾病中有巨大的潜能［1］。近年来研究表明，环氧酶-2（cycloxygenase-2，COX-2）在骨折愈合和MSCs成骨分化中具有重要作用［2］。非甾体抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）作为环氧酶抑制剂，临床上常用于骨折或创伤手术后缓解疼痛。但NSAIDs能抑制前列腺素生成，致骨折愈合延迟及骨不连接发生［3－4］。骨形态蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是转化生长因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成员之一，对胚胎时期骨发育和成年骨缺损的修复起重要作用，同时也参与机体某些疾病的发生发展过程［5］。

Bonemorphogenetic protein 9（BMP9）是目前发现的BMPs成员中，诱导MSCs成骨分化能力最强的因子［6］，但BMP9诱导MSCs成骨分化的具体机制及影响因子还不十分清楚。本研究主要探讨COX-2在BMP9诱导MSCs成骨分化过程中的作用，以及COX-2影响BMP9诱导MSCs成骨分化的可能机制。研究结果对于进一步深入研究 BMP9诱导MSCs成骨分化的机制，促进组织骨工程的发展具有重要意义，并且能为临床合理用药提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及试剂间充质干细胞C3H10T1/2购自American Type Culture Collection公司。采用DMEM培养基（高糖）（含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L－1和链霉素 100 mg·L－1）培养细胞，培养条件为5%的CO2及37℃。NS-398（选择性COX-2抑制剂）购自Sigma-Aldrich公司。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）化学发光检测试剂盒购自BD Clontech公司。所用抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司。Lipofectamine购自Invitrogen公司。

1.2 重组腺病毒的构建本实验所用重组腺病毒均采用 Ad-Easy系统构建［7］。构建方法如下：用PCR从EST克隆中扩增目的基因的编码序列，并克隆到穿梭质粒。最后将穿梭质粒线性化并与含腺病毒骨架序列的质粒进行重组，将重组正确的质粒线性化并转染到HEK-293细胞（human embryonic kidney-293）进行病毒包装，得到目的基因编码序列的重组腺病毒。即GFP重组腺病毒（Ad-GFP）、BMP9重组腺病毒（Ad-BMP9）和COX-2沉默siRNA片段重组腺病毒（Ad-simCOX-2）。Ad-GFP作为空载重组腺病毒对照。

1．3 RT-PCR实验将指数生长的细胞种于T25培养瓶中，待细胞贴壁后按实验分组加入相应处理因素，于相应时间点提取总RNA。提取总RNA前24 h，将完全培养基换为含1%胎牛血清的完全培养基。采用异硫氰酸胍－酚－氯仿法提取总RNA。通过RT反应获得cDNA，并将cDNA作为模板通过定量PCR或普通PCR检测目的基因表达情况。每组实验重复3次。实验所用PCR引物如下：GAPDH，上游5′-ACCCAGAAGACTGTGG ATGG-3′，下游5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′；COX-2，上 游5′-AGAAGGAAATGGCTGCAGAA-3′，下游 5′-GCT CGGCTTCCAGTATTGAG-3′；Smad6，上游 5′-GTG TTGCAACCCCTACCACT-3′，下游 5′-GACATGCTGGCATCTGAGAA-3′；Smad7，上游 5′-GCATCTTCTGTCCCTGCTTC-3′，下 游 5′-CCGGTCTTCCTTTCCTTTTC-3′。

1.4 免疫细胞化学染色将指数生长的细胞种于24孔板，待细胞贴壁后按实验分组加入相应处理因素，并于相应时间点进行免疫细胞化学染色。操作过程如下：弃培养基，用 PBS（4℃）清洗 1次；用10%甲醛固定细胞，吸去固定液后用PBS（4℃）清洗2次；用1%NP-40和10%山羊血清封闭30 min，然后加入相应的一抗，以羊源的IgG作为阴性对照，孵育1 h；弃一抗，用PBS清洗3次，每次5 min。然后加入相应的二抗，孵育30 min。弃二抗，用PBS清洗3次，每次5 min。最后用DAB显色。每组实验重复3次。

1．5 Western blot实验将指数生长的细胞种于6孔板中，待细胞贴壁后按实验分组加入相应处理因素，于相应时间点提取总蛋白，并采用BCA法测定总蛋白浓度。用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，按常规方法进行Western blot操作。最后采用ECL化学发光法显色，用凝胶成像仪成像。每组实验重复3次。

1．6 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性测定将指数生长的细胞种于24孔板，待细胞贴壁后按实验分组加入相应处理因素，分别于d 5、7、9测定ALP活性。具体方法参照文献［6，8］，并适当改进：先吸去培养基，每孔加入100μl裂解液，裂解5 min，收集裂解液并离心弃沉淀。反应体系组成为15μl缓冲液、5μl裂解液和5μl反应底物。室温下孵育25 min，然后用Promega萤光素酶分光光度计测定ALP活性。另用BCA法测定蛋白浓度，用以校正ALP活性。每组实验重复3次。

1.7 体内异位成骨实验将C3H10T1/2细胞用相应的重组腺病毒载体感染，24 h后收集细胞并计数。将细胞离心后，用PBS重新混悬，调整细胞浓度（1010·L－1）。将细胞种植于裸鼠背部右侧皮下（5×106/注射位点），每组5只裸鼠。接种细胞5周后，处死裸鼠并收集标本，将标本脱钙后进行石蜡包埋、切片、HE染色。

1.8 萤光素酶报告质粒实验将指数生长的细胞种于T25培养瓶中，待细胞贴壁后，用Lipofectamine转染 BMPR-Smad报告质粒（p12xSBE-Luc，Smad binding elements，SBE）2μg，4 h后换液，加入正常完全培养基。16 h后，将细胞消化重新种于24孔板，待细胞贴壁后按实验分组加入相应处理因素。24 h后裂解细胞，收集裂解液并离心弃沉定。按试剂盒的操作说明测定荧光素酶活性。采用BCA法测定蛋白浓度，用以校正萤光素酶活性。每组实验重复3次。

1.9 统计学分析用Microsoft Excel进行统计分析，数据用±s表示，组间比较t检验。

2 结果

2．1 BMP9在 C3H10T1/2细胞中诱导 COX-2表达

定量PCR结果显示，C3H10T1/2细胞用BMP9处理后，COX-2表达明显增加，72 h增加最明显（Fig 1A）；Western blot和细胞免疫组化染色显示同样的结果（Fig 1B，C）。提示COX-2作为BMP9的重要靶基因之一，在BMP9诱导MSCs成骨分化的过程中可能具有重要作用。

Fig 1 Effect of BMP9 on expression of COX-2 in C3H10T1/2 cells

2．2 抑制COX-2酶活性或沉默COX-2表达均对BMP9诱导C3H10T1/2细胞ALP活性增加具有抑制作用实验结果显示，COX-2选择性抑制剂NS-398能明显抑制 BMP9诱导 C3H10T1/2细胞的 ALP活性增加，并具有浓度依赖性（Fig 2A）；沉默COX-2表达同样能明显抑制 BMP9诱导 C3H10T1/2细胞ALP活性增加 （Fig 2B）。提示COX-2在BMP9诱导C3H10T1/2细胞ALP活性增加中具有调节作用。

2．3 沉默 COX-2抑制 BMP9在 C3H10T1/2细胞中诱导Runx2、Dlx-5表达实验结果显示，用BMP9感染C3H10T1/2细胞后，成骨分化重要转录调节因子Runx2和DLX-5表达较对照组（用Ad-GFP处理）明显增加。沉默COX-2本身对Runx2和DLX-5没有明显影响，但在BMP9合并COX-2沉默表达组中Runx2和DLX-5表达水平较BMP9处理组明显降低（Fig 3 A，B）。提示COX-2可能对BMP9诱导C3H10T1/2细胞表达Runx2和Dlx-5具有一定的调节作用。

2．4 沉默 COX-2抑制 BMP9诱导 C3H10T1/2细胞的异位成骨能力实验结果显示，单独GFP处理组或COX-2沉默表达组均无异位成骨发生，BMP9处理组与BMP9合并COX-2沉默表达组均有异位成骨发生；但是BMP9合并COX-2沉默表达组异位成骨的质量（Fig 4）明显低于单用BMP9处理组。提示COX-2对BMP9诱导C3H10T1/2细胞异位成骨的过程可能具有重要调控作用。

2．5 沉默 COX-2表达抑制 BMP9在 C3H10T1/2细胞诱导BMP/Smads信号通路活化实验结果显示，BMP9处理组BMPR-Smad报告质粒荧光素酶的活性明显高于GFP对照组（P＜0.01）；BMP9合并COX-2沉默表达组中萤光素酶的活性明显低于单用BMP9组（P＜0.01，Fig 5A）。Smad1/5/8磷酸化水平呈现相同的变化趋势（Fig 5B）。BMP9处理组Smad6和Smad7表达水平明显高于GFP对照组，而BMP9合并COX-2沉默表达组中Smad6和Smad7的表达水平则明显低于BMP9处理组（Fig 5C）。以上结果提示，COX-2在BMP9诱导MSCs成骨分化中的作用可能涉及对BMPs/Smads信号转导活性的调节。

3 讨论

Fig 2 Effect of NS-398 or COX-2 knockdown on BMP9 induced ALP activities in C3H10T1/2 cells

Fig 3 Effect of COX-2 knockdown on protein level of Runx2 and Dlx-5 induced by BMP9 in C3H10T1/2 cells

骨缺损及骨不连接是临床常见的骨科疾病，组织工程骨是治疗骨缺损及骨不连接的理想材料。间充质干细胞（MSCs）具有多向分化潜能，是组织骨工程中的理想种子细胞，如何促进MSCs有效成骨分化是该领域目前的研究热点之一［9］。研究表明［10－11］，COX-2在骨折修复及愈合中具有重要作用，COX-2抑制剂能延迟骨折愈合并能导致骨不连接。BMP9是目前已知的诱导MSCs成骨分化能力最强的因子之一，但COX-2对BMP9诱导干细胞成骨分化的影响尚不清楚。C3H10T1/2细胞是公认的MSCs，具有多向分化潜能。因此本研究利用C3H10T1/2细胞分析BMP9诱导MSCs成骨分化与COX-2的关系。结果发现，BMP9在MSCs中可诱导COX-2表达，并且COX-2可通过调节BMPs/Smads信号转导，影响BMP9诱导的MSCs成骨分化。

Fig 4 Effect COX-2 knockdown on ectopic bone formation induced by BMP9 in C3H10T1/2 cells

BMPs属于TGF-β超家族成员之一，目前已分离和鉴定了20余种。BMPs被认为是与干细胞成骨分化相关的因子，但随着研究的不断深入，现认为BMPs具有多种生物学功能。BMPs不但在胚胎时期对骨组织的发育和成年骨缺损修复中具有重要作用，而且与机体某些疾病发生有关［12］。BMPs通过BMPs-Smad信号通路发挥相应的生物学作用。成骨性BMPs与相应的受体（BMPⅠ型和Ⅱ型受体）结合后，引起下游成骨性 Smads磷酸化（Smad1/5/8），继而与Smad4形成复合物并转位入核，调节相应的靶基因表达，如 Runx2、Osterix和 Dlx-5等［13－14］。He等［6］系统分析了BMP2至BMP15共14种 BMPs对MSCs成骨分化的影响，发现除传统的BMP2和BMP7外，BMP4、BMP6和 BMP9也能诱导 MSCs成骨分化，并且BMP9诱导MSCs成骨分化的能力明显强于其他 BMPs成员。因此，研究 BMP9诱导MSCs成骨分化的机制及其影响因素具有重要临床意义。

Fig 5 Effect of COX-2 knockdown on BMPs/Smads signal transduction induced by BMP9 in C3H10T1/2 cells

环氧酶（cyclooxygenase）是合成前列腺素的限速酶，目前已发现3种异构体，即环氧酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）、环氧酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和环氧酶-3（cyclooxygenase-3，COX-3）。COX-2选择性抑制剂，因不良反应较少而广泛应用于临床，包括骨科疾病的术后镇痛。研究表明：COX-1在正常骨组织及受损骨组织中均有表达，但COX-2只在骨折后修复的早期表达增加；COX-1（－/－）小鼠的骨折愈合过程正常，COX-2（－/－）小鼠的骨折愈合不但明显延迟，并且COX-2（－/－）小鼠来源的骨髓间充质干细胞成骨分化也明显受到抑制［15］。Spiro等［16］证实，COX-2抑制剂对 BMP7促进骨折修复和诱导MSCs异位成骨均具有抑制作用。课题组前期研究表明，美洛昔康对BMP9诱导的MSCs成骨分化具有抑制作用［17］。提示COX-2在BMP9诱导MSCs成骨分化过程中可能具有重要作用，但BMP9与COX-2的关系及COX-2在BMP9诱导MSCs成骨分化的调节机制还不清楚。

通常认为前列腺素对骨代谢具有重要作用，其中前列腺素E2（PGE2）最重要；PGE2主要与EP2和EP4受体结合并激活PKA，通过cAMP途径发挥对骨代谢的调节作用［18－19］。我们的实验结果显示，BMP9在MSCs中明显诱导COX-2表达，并且COX-2选择性抑制剂或沉默COX-2表达对BMP9诱导的干细胞成骨分化均具有明显抑制作用。沉默COX-2表达不但明显降低BMPR-Smad报告质粒的萤光素酶活性，抑制Smad1/5/8的磷酸化，而且也明显降低BMP9诱导抑制性 Smads（Smad6/7）表达。提示COX-2对BMP9诱导BMPs/Smads信号通路活化具有重要调节作用。但是，目前还不清楚COX-2对BMP9诱导MSCs成骨分化的影响与EP受体/PKA/cAMP途径的关系，以及COX-2是否还能通过其他途径调节BMP9诱导MSCs成骨分化。

本研究证实BMP9在MSCs中能够诱导COX-2表达，并且COX-2在BMP9诱导的干细胞成骨分化过程中具有重要调节作用；这种作用可能与COX-2调节BMPs/Smads信号转导有关；研究结果对于进一步深入研究BMP9诱导MSCs成骨分化的机制，促进组织骨工程的发展，以及指导临床合理使用COX-2抑制剂具有重要意义。

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