靶向作用p53药物的研究进展

代晓丽，刘 静，罗 瑛，张继虹

（昆明理工大学1.生命科学与技术学院、2.医学院，云南昆明 650500）

p53基因的研究起源于一种在肿瘤细胞内表达水平很高［1］，与SV40病毒大T抗原相结合，分子质量约53 ku的蛋白［2］。后来研究发现p53基因在大多数肿瘤细胞中以突变形式存在，能诱导和促进肿瘤发生，而以野生形式存在的p53基因，却可以抑制肿瘤发生和发展［3］，野生型p53作为一个关键的转录调控因子，反式激活下游靶向基因的表达［4］。突变型p53不仅失去肿瘤抑制功能，而且具有获得性新功能（gain of function，GOF），比如：负显性（dominantnegative，DN）抑制野生型p53的转录活性，诱导某些基因的异常表达［5］。野生型p53作为一个关键的转录调控因子，反式激活下游靶向基因的表达，而且，两种状态的p53基因在肿瘤的发生、发展中有着截然相反的作用，使其成为当前分子靶向抗肿瘤药物研究很有吸引力的目标靶点。近年来，很多小分子化合物、多肽等都被证实以p53为作用靶点而产生抗肿瘤生物活性［6］。本文将着重阐述以p53为靶点的药物研究进展，进而讨论相关化合物在肿瘤治疗中的作用机制。

1 p53基因突变与肿瘤

分析显示，很多p53突变的癌症病人存活率相对较低［7］。p53突变大部分是单个氨基酸发生替换的错义突变。已知的热点突变可分为两类：一类是直接导致p53与DNA结合能力改变的氨基酸残基突变（R248Q、R273H）；另一类是导致突变位点原位突变（R249S、G245S）或蛋白整体的构象扭曲（R175H、R282W）的突变［8］。突变位点位于编码DNA结合区内的错义突变，通常会失去特异的转录激活功能（loss of function，LOF），进而失去肿瘤抑制活性［9］。同时，突变型p53的分子构象发生改变，使其变得很难降解，最终导致半衰期延长。

2 以p53为靶点药物的作用方式

目前，以p53为靶点的药物主要有4种作用方式（Fig 1），① 基因治疗：基因药物是完全复制p53基因，采用特定的病毒载入细胞内，直接替代p53基因，恢复反式转录激活功能。这些基因治疗药物中，Gendicine和Advexin在美国已经分别进入临床Ⅰ期和Ⅲ期研究［10］，而中国已经投入临床使用［11］。还有ONYX-015是根据E1B蛋白敲除的腺病毒设计的，对p53缺失的癌细胞活性很好［12］。但是，基因药物有一定局限性，它不是对所有细胞都起效。② p53-MDM2/MDM4（murine doubleminute 2，MDM2）作用抑制：小分子化合物靶向干扰p53-MDM2/MDM4复合体的形成，进而积累野生型p53（该部分将在3.靶向作用野生型p53的药物中将详细阐述）。③突变p53构象改变：小分子化合物通过共价结合等方式修饰p53结构，使其构象改变，恢复转录激活功能。④疫苗治疗：癌症病人的突变p53具有免疫性，自身能产生p53激活的免疫细胞CD4和CD8［13］，目前已经通过临床验证的疫苗包括：p53基因合成长肽疫苗（p53-SLP）治疗大肠癌［14］；INGN-225修饰 p53腺病毒治疗非小细胞肺癌［15］。p53突变存在于大部分癌症病人中，使靶向恢复突变p53功能的化合物具有广泛性，并使其有可能成为靶向药物。

3 靶向作用野生型p53的药物

E3泛素连接酶MDM2是p53抑制肿瘤的主要调节者［16］。它以两种方式调节p53功能，即介导p53蛋白降解和抑制p53的转录活性。MDM2的疏水基团与p53的转录激活域的 NH2端关键的疏水残基（Phe19、Leu22、Trp23、Leu26）结合，促进野生型p53蛋白泛素化降解，形成一个负反馈调节回路。当DNA损伤时，细胞核内p53水平升高，激活MDM2基因转录，进而增强MDM2蛋白表达。MDM2蛋白特异性地与p53结合，抑制p53转录功能，促进p53向核外转运，并作为E3泛素连接酶使p53蛋白经泛素化途径降解，使之不可逆地失活。MDM2过表达可以阻滞p53介导的反式激活作用，使p53功能丧失，显示出癌蛋白的活性，参与肿瘤的形成。

Fig 1 Four main classes of p53 targeting therapeutics

p53-MDM2抑制剂作用机制主要有2条途径：① 干扰p53-MDM2复合物形成，阻止p53蛋白泛素化降解；② 修饰p53转录活性区，稳定 p53蛋白。目前发现的干扰 p53-MDM2相互作用的化合物有：nutlin、spiroindoles和 quinolinols等（Fig 2）。这类小分子化合物的作用靶点目前的研究已经比较深入，如Tab 1所示。

Tab 1 p53-targeting drugs in（pre-）clinical development

nutlins是阻断MDM2-p53相互作用的小分子化合物［17］。nutlins分子式中含有顺式－咪唑结构，能模拟替代p53占据p53-MDM2复合体上的结合位点，阻止p53蛋白泛素化降解，进而发挥抗肿瘤作用。nutlins选择性抑制野生型p53细胞，稳定p53蛋白和激活p53活性［17］。相比于传统的基因毒性抗癌药物，同系物nutlin-3既不会诱导DNA损伤，也不会促使p53磷酸化，而是对MDM2具有高度的专一性和互补性［18］。

Ding等［19］发现螺吲哚酮类化合物在不同的细胞系中能抑制p53-MDM2的相互作用，所以通过构象设计出其衍生物MI-63和MI-219。以往的p53-MDM2抑制剂大部分是根据他们之间的3个氨基酸Phe19、Leu26和Trp23设计的，而MI-63和MI-219的设计还加入了对p53-MDM2结合有重要作用的氨基酸Leu22。因此，MI-63与MDM2具有高度亲和性，显示出良好的药效学和生物利用度［20］。另外，Shangary等［21］设计的MI-219还与HDM2结合，具有很好的药动学，起效很快，并且毒性较小。

此外，Yang等［22］在化合物库中通过高通量（high-Throughput Screening，HTS）筛选出的一个 HDM2（human doubleminute 2，HDM2）连接酶抑制剂HLI98，它阻止p53蛋白泛素化降解，增加细胞核内p53的含量，选择性的杀死野生型p53的肿瘤细胞。但是，HLI98的水溶解性不好，限制它的药效。其衍生物HLI373，干扰HDM2-p53作用和诱导细胞死亡活性比HLI98强，且对DNA损伤剂敏感的肿瘤细胞有很强的促凋亡作用［23］。

Fig 2 Structures of p53-targeted com pounds

研究还发现直接作用于野生型p53的药物RITA。它能与p53的N端结合，进而稳定p53蛋白的构象，激活野生型p53转录激活功能。最新的研究发现，RITA可以与多种蛋白质结合，激活DNA损伤反应途径；它还可以重新激活p53介导的细胞凋亡。然而，Krajewski等［24］通过核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）数据证明RITA并没有直接与p53结合。所以，RITA的作用机制仍有争议，有待进一步研究。

研究者后来发现，MDMX也是一类与p53结合的蛋白，与MDM2有着特定的同源序列［25］，蛋白结构非常相似。它没有泛素化降解p53蛋白活性，但是MDMX与MDM2碳端的环状结构域相互作用，会促进 MDM2发挥降解p53活性［26］。所以运用药物同时干扰p53-MDM2和p53-MDMX相互作用是高效率的治疗途径。例如通过高通量筛选出的p53-MDM2抑制剂 SJ-172550也是 MDM4抑制剂［27］。还有XI-006（NSC207895）可以抑制 MDM4的转录［28］。

4 靶向作用突变型p53的药物

p53基因突变在癌症中很常见，相对于直接激活野生型p53更具有广泛性。同时，突变p53蛋白突变体也会积累，会失去MDM2的负调控作用，形成更稳定的四聚体［29］。75%的p53基因突变会降低其与DNA特异序列结合能力，促进肿瘤的发生、发展和转移，以及增强基因组的不稳定性［30］。另外，突变p53会与转移生长因子（TGF-β）协同作用抑制p63，诱导癌细胞转移。突变型p53虽然依然保留着N端的转录域，但它直接或间接影响调控基因的表达。Strano等［31］发现R175H突变p53可以诱导DNA结合抑制因子ID4的表达。所以，通过药物作用恢复突变p53的构象是一个有效的对策。目前发现的靶向作用突变型p53的小分子化合物的结构式如Fig 2所示。它们的作用靶点和研究现状见Tab 1。

研究初期，Foster［32］通过体外筛选实验在小分子化合物库中筛选出能恢复p53构象的苯乙烯基喹唑啉类化合物CP-31398。研究发现，CP-31398结合DNA核心结合域，从而恢复突变p53构象［32］。然而，通过核磁共振分析，未能检测到分子与DNA核心域结合的产物［33］。也有报道，CP-31398是通过减弱 p53的泛素化降解来提高p53转录活性［34］，CP-31398的作用机制有待进一步研究。

后来还发现ellipticine可以恢复突变型p53的反式激活功能，诱导p53应答基因（p21、MDM2），还改变突变型p53的构象，在体内增加序列特异性［35］。另外，联合 p53的DNA结合结构域（氨基酸92－312）融合谷胱甘肽转移酶（glutathione-s-transferase，GST）预孵育筛选出的化合物P53R3。它可以恢复内源性表达突变p53基因（R175H、R273H）的序列特异性［36］。P53R3相对于其他化合物具有更强p53依赖的抗增殖性能和更广泛的特异性突变［36］。此外，Kravchenko等［37］使用转录受体实验尝试筛选得到RETRA，它能作用于不同类型p53突变的癌细胞。通过阻断p53－p73复合物的形成，增加p73的表达，进而上调p21，导致癌细胞凋亡。p53突变类型比较多，研究人员针对不同的突变，可以进行更深的分子机制研究。

化合物PRIMA-1和MIRA-1是Bykov等［38］通过体外细胞实验，从化合物库中筛选出的。PRIMA-1可以激活p53，抑制细胞大量凋亡。MIRA-1则呈现突变p53依赖型诱导细胞急速凋亡。后来又发现 STIMA-1、MIRA-1、WR1065和 PRIMA-1MET（APR-246）。化合物 STIMA-1和 WR1065分子中的巯基（SH）靶向结合突变p53，诱导癌细胞凋亡。MIRA-1则是一种Michael受体，通过马来酰亚胺激活碳碳双键，参与Michael加成反应，修饰半胱氨酸蛋白来发挥抗肿瘤活性。这些化合物因为溶解性差和细胞毒性较大，所以不适合进一步的药物开发，但是他们都证明了一个共同的作用机制即改变突变p53蛋白构象。所以，研究PRIMA-1和PRIMA-1MET激活突变型p53的分子机制是相关药物进一步的优化、新型化合物的设计与改进的基础。目前发现其作用机制是：PRIMA-1在体内代谢后转化成比较稳定的亚甲基奎宁环酮MQ，参与Michael加成反应，作为Michael受体，通过硫醇基官能团，共价修饰DNA核心结合域，改变p53蛋白构象，激活转录活性［38］。衍生物 PRIMA-1MET（APR-246）活性比母体化合物PRIMA-1强［39］。PRIMA-1和PRIMA-1MET除了恢复突变p53构象外，还会干扰突变p53和p63、p73形成复合物，诱导细胞凋亡［40］。类似的 STIMA-1、MIRA-1、PRIMA-1和 PRIMA-1MET的化合物都是体内的代谢物，作为Michael受体，使突变型p53的重新激活。因此，他们都可以被视为前体药物。

Joerger等［41］通过X射线做了很多p53结合域的结构信息。研究者可以根据这些结构信息设计出专一性结合突变p53核心结合域，稳定构象的化合物。Y220C突变在肿瘤中很容易发生。因此，研究者针对这种突变用硅胶筛选、核磁共振检测等技术发现了80个化合物。其中，PhiKan083更易阻断p53的Y220C位点突变。一系列的突变型p53蛋白晶体结构测定显示，其原理是Y220C突变在蛋白的核心结构域会产生一个具有约束力的节点［41］。PhiKan083可以与这个位点结合来产生活性。通过X射线分析p53-Y220C-Phi-Kan083复合物的结构发现，药物确实与核心域的节点相结合。由于全球癌症患者中携带Y220C突变的人数很多，虽然PhiKan083只是针对p53的Y220C的一个位点突变的药物，但它依然是癌症治疗中不可或缺的。

5 总结与展望

癌症是一类复杂的疾病，与遗传基因、表观遗传改变等多种因素有关。因此，通过对肿瘤分子生物学和信号通路等的充分理解，设计合理的靶向化合物来实现癌症的个性化治疗。此外，p53基因与肿瘤的凋亡和耐药密切相关，许多抗肿瘤药物能启动靶细胞的凋亡，控制药物的细胞毒性作用，并可用来设计药物和化疗策略［42］。深入研究靶向p53化合物及其作用机制，将会促进癌症的个性化治疗。例如，使用化学药物与p53靶向药物组合进行治疗，可以增强药物对突变p53肿瘤的疗效，降低对正常细胞和组织的毒副作用。另外，使用相同信号转导通路的药物联合使用，可以实现协同作用。例如，nutlins或MI-219联合使用，既可以激活p53，又可以降低MDM2的积累［43］。目前对p53为靶点的药物研究在治疗癌症方面已经成为焦点，发现天然产物中针对p53为靶点的药物也是一个充满希望的方向。

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