黄芩素激活核转录因子Nrf2拮抗肝毒性的研究

庞 纯，蒋 萍，季莉莉

黄芩素是中药黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）中含有的重要单体，属黄酮类化合物，具有抗菌、抗病毒、抗炎、保肝利胆、利尿、抗癌等多种药理作用，临床主要用于抗菌消炎和抗感染［1］。黄芩素的结构中含酚羟基较多，因此可以与自由基反应生成稳定的半醌自由基从而发挥抗氧化作用。本实验室前期研究发现黄芩素可以抑制川楝素、千里光碱、APAP等肝毒性物质诱导的L-02细胞和小鼠原代肝细胞的毒性［2－3］，但是其抑制肝毒性的作用机制尚不清楚。

近年来研究发现，核因子NF-E2相关因子（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）可以通过与抗氧化反应元件 （antioxidant responsive element，ARE）相互作用从而调节编码一些重要的抗氧化蛋白，这是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路［4］。大量研究表明［5～7］，氧化应激在APAP、CCl4、乙醇等肝毒性物质诱导的肝细胞损伤中发挥了重要的作用。本研究采用瞬时转染报告基因实验，依靠双荧光素酶报告基因载体和转染技术，检测不同浓度黄芩素对核转录因子Nrf2的转录激活；并进一步考察了黄芩素对肝毒性物质APAP、CCl4、乙醇诱导的肝L-02细胞毒性的影响。

1 材料与试剂

1.1 细胞株 人正常肝细胞株L-02（中国科学院细胞库）。

1.2 药物 黄芩素由上海中药标准化中心提供，化合物结构主要经核磁共振氢谱（1H-NMR）和核磁共振碳谱（13C-NMR）鉴定，纯度98%以上。

1.3 试剂 对乙酰氨基酚 （APAP）、溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）2，5-二甲苯基四氮唑 （MTT）（Sigma公司）；无水乙醇、四氯化碳（上海国药集团有限公司）；Penicillin／Streptomycin、胎牛血清（FBS）、RPMI 1640和 Opti-MEM培养基 （Gibco公司）；Nrf2 Cignal Reporter Assay试剂盒、Attractene转染试剂（QIAGEN公司）。

1.4 仪器 恒温培养箱（Thermo），生物安全柜（Labconoc），BioTek Synergy H4酶标仪（Bio-Tek），离心机（Eppendorf），荧光倒置显微镜（Olympus），超纯水过滤仪（MILLIPORE），培养皿、96孔培养板、离心管（Greiner）。

2 方法

2.1 药物配制 黄芩素用二甲亚砜（DMSO）溶解，配制成0.1 mol·L－1的母液；APAP用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，配制成 0.1 mol·L－1的母液，用0.22 μm的一次性灭菌滤器过滤除菌；CCl4用4.82 ml原液溶于 5.18 ml DMSO中，配制成 5 mol·L－1的CCl4母液；Ethanol用0.58 ml的无水乙醇混于无血清的RPMI 1640培养液配成10 ml的1 mol·L－1母液。加药时用无血清的RPMI 1640培养液按比例稀释至所需浓度，并确保DMSO在培养液中的终浓度不超过0.1%。

2.2 细胞培养 将人正常肝L-02细胞接种于含10%灭活胎牛血清、10万U·L－1青霉素和100 mg·L－1链霉素的 RPMI 1640培养液中，在 37℃，5%CO2的培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。

2.3 Cignal报告基因法检测Nrf2的激活 转染前24 h，按细胞数3×104个／孔接种细胞至96孔培养板。根据试剂盒说明书，转染时分别将Cignal报告基因质粒、Cignal阴性对照质粒、Cignal阳性对照质粒与Attractene转染试剂以及Opti-MEM培养基混匀孵育后加入96孔板，置培养箱培养16 h后，更换为含0.5%FBS的Opti-MEM培养液，同时在荧光显微镜（激发波长470 nm＋20 nm，发射波长515 nm）下检测Cignal阳性对照质粒的转染效率。转染24 h后加不同浓度的黄芩素（0、10、25、50μmol·L－1），孵育18 h后用双荧光素酶活性分析试剂盒提供的方法，在酶标仪上分别测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性值，结果以两者的比值表示。

2.4 MTT法检测细胞存活率 取对数生长期的细胞，制成细胞悬液，以1×104个／孔接种到96孔板中，12 h后，细胞贴壁生长状态良好，加入不同浓度黄芩素（1、10、25、50、100μmol·L－1）与细胞预孵15 min后，加入肝细胞毒性物质（终浓度10 mmol·L－1APAP，100 mmol·L－1Ethanol，10 mmol·L－1CCl4，各组均没有明显的pH变化）。空白对照组加入含等量DMSO的细胞培养液而不加任何药物。共同孵育48 h后加入MTT 10μl（终浓度0.5 g·L－1），置培养箱孵育4 h后加三联剂 （10%SDS－5%异丁醇 －0.01 mol·L－1HCl），继续培养至结晶完全溶解，然后取出96孔板，在酶标仪570 nm和630 nm参考波长处读取吸光度值。将空白组作为对照，按下述公式计算细胞存活率：细胞存活率／%＝给药组OD（570 nm－630 nm）／对照组OD（570 nm－630 nm）×100%。

2.5 统计学处理 实验数据均用¯x±s表示，采用SPSS 16.0统计软件进行分析，以One-Way ANOVA方式进行方差分析，两两比较采用LSD法。

3 结果

3.1 黄芩素明显诱导Nrf2的转录激活 与对照组比较，10μmol·L－1黄芩素对Nrf2的转录激活没有明显的影响（P＞0.05），而25和50μmol·L－1黄芩素能明显提高 Nrf2的转录激活（P＜0.01，P＜0.05），见 Fig 1。

3.2 黄芩素明显逆转给予APAP、CCl4和Ethanol后降低的L-02细胞存活率 与对照组比较，APAP、CCl4、Ethanol均能明显降低人正常肝L-02细胞存活率 （P＜0.01）；细胞经不同浓度黄芩素 （1、10、25、50、100μmol·L－1）预处理15 min后，各浓度黄芩素均能明显提高APAP肝细胞损伤模型组的细胞存活率（P＜0.01），且呈现一定的剂量依赖性；25、50、100 μmol·L－1黄芩素能明显提高CCl4肝细胞损伤模型组的细胞存活率（P＜0.01），且呈现一定的剂量依赖性；50、100μmol·L－1黄芩素对 Ethanol肝细胞毒性具有明显拮抗作用 （P＜0.01），见Tab 1。

Fig 1 Effects of Baicalein on the activation of Nrf2

Tab 1 Protection of Baicalein against APAP，CCl4，and Ethanol-induced hepatotoxicity in L-02 cells（¯x±s，n＝5）

4 讨论

肝脏是人体最重要的代谢器官，外源性物质在肝内经氧化还原后产生多种自由基，可引起肝组织的氧化损伤。氧化应激产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）直接或间接地损伤细胞内蛋白质、脂质等大分子物质的生理功能，机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统来应对自由基和有毒物质的损害［8］。Nrf2是调节抗氧化应激反应的重要转录因子，其通过与ARE相互作用调节编码抗氧化蛋白的表达［4，9］。正常情况下，Nrf2作用被其特异性受体Keap1所抑制；在氧化应激等情况下，Nrf2与Keap1解离而被激活，启动ARE调控的Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的表达，增加细胞抵御氧化应激和亲电子化学物质的损伤［9－10］。

大量研究表明，APAP、CCl4、乙醇诱导的肝毒性均与氧化应激产生的自由基导致肝脏氧化损伤密切相关。Liu等［11］和 Reisman等［12］证明：对乙酰氨基酚、四氯化碳、镉、溴苯等均能降低大鼠及小鼠肝脏Nrf2及其下游的抗氧化酶基因 NQO1（NADPH：quinine oxygenase 1）、HO-1（heme oxygenase 1）等的表达，而齐墩果酸可逆转这些基因表达的降低。又有文献报道［13－14］，Nrf2（－／－）小鼠对 APAP和CCl4诱导的肝毒性比野生型小鼠更敏感。Lamlé等［15］报道：Nrf2（－／－）小鼠对酒精的耐受性比野生型小鼠明显降低，短时间内就能发生肝衰竭，最终导致死亡。因此，抗氧化成为治疗APAP、乙醇等诱导的肝损伤的一个重要手段。

本研究应用Cignal Reporter法检测到黄芩素能明显提高Nrf2的转录活化，并发现黄芩素对肝毒性物质APAP、CCl4和Ethanol诱导的 L-02肝细胞毒性有明显的抑制作用。我们结果提示黄芩素可能是通过提高细胞内重要的抗氧化转录因子Nrf2的激活，从而发挥抑制APAP、CCl4和Ethanol诱导肝细胞毒性的作用。

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