3-酰胺基-吲哚类衍生物及其有关物质含量测定*

申冬妮,杨建云,肖炳坤,黄荣清

(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京 100850)

·药物制剂与药品质量控制·

3-酰胺基-吲哚类衍生物及其有关物质含量测定*

申冬妮,杨建云,肖炳坤,黄荣清

(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京 100850)

目的 建立反相高效液相色谱法测定3-酰胺基-吲哚类衍生物及其有关物质含量。方法采用Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇∶乙腈∶水(43∶12∶45),流速1.0mL·min-1;检测波长224 nm;进样量20μL;柱温:室温。结果3-酰胺基-吲哚类衍生物与有关物质能达到较好分离,在0.04～0.16 mg·mL-1浓度范围内与峰面积线性关系良好,r=0.999 7;方法重复性RSD为0.52%;检测限为2.65 ng。结论该方法准确可靠,灵敏度高,专属性好,可用于3-酰胺基-吲哚类衍生物及其有关物质含量测定。

3-酰胺基-吲哚类衍生物;色谱法,高效液相;含量测定

抑郁症是一类严重危害人类身心健康的常见精神疾病,主要表现为情绪低落,兴趣丧失,思维迟钝,意志行为减少,严重者伴有自杀观念和行为。当前世界十大疾病中,抑郁症名列第五位,其患病率已经超过了人们认为很常见的咽喉炎和冠心病,而且预计到2020年将跃升到第二位[1-2]。3-酰胺基-吲哚类衍生物为本所合成的褪黑素类衍生物,可以增加褪黑素受体亲和性,有抗抑郁的作用。笔者建立了简便、准确的高效液相色谱(HPLC)分析方法,用于测定3-酰胺基-吲哚类衍生物含量及其有关物质,为其质量的可控奠定了基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695-2996高效液相色谱仪(四元泵,二极管阵列检测器,自动进样器,Empower色谱工作站)。

1.2 试药 甲醇和乙腈均为色谱纯,水为娃哈哈纯净水。3-酰胺基-吲哚类衍生物对照品(军事医学科学院放射与辐射医学研究所自制,含量:99.6%)；3-酰胺基-吲哚类衍生物供试品(军事医学科学院放射与辐射医学研究所自制,批号分别为20121011,20121015, 20121018)。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品储备液 取3-酰胺基-吲哚类衍生物对照品约20 mg,精密称定,置50 m L量瓶中,加适量流动相超声助溶,冷却至室温,加流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液。

2.1.2 对照品溶液 取对照品储备液2 mL至10 mL量瓶中,加流动相稀释至刻度摇匀,作为对照品溶液。

2.1.3 供试品储备液 取3-酰胺基-吲哚类衍生物供试品约10 mg,精密称定,置25 m L量瓶中,加适量流动相超声助溶,冷却至室温,加流动相稀释至刻度,摇匀,作为供试品储备液。

2.1.4 供试品溶液 取供试品储备液2 mL至10 mL量瓶中,加流动相稀释至刻度摇匀,作为供试品溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性实验 采用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱；流动相:甲醇-乙腈-水(43∶12∶45)；检测波长224 nm；流速1.0 m L·min-1；进样量20μL；柱温:室温。理论板数以3-酰胺基-吲哚类衍生物计算不低于5 000。

按上述色谱条件,将对照品溶液、供试品溶液各20μL分别进样,3-酰胺基-吲哚类衍生物的保留时间约为14 min,主峰与有关物质峰能得到良好分离(R＞1.5)。见图1。

A.3-酰胺基-吲哚类衍生物对照品;B.3-酰胺基-吲哚类衍生物供试品;1.3-酰胺基-吲哚类衍生物图1 两种溶液的HPLC色谱图A.3-amido-indole derivative control solution；B.sample solution of 3-amido-indole derivatives；1.3-amido-indole derivativesFig.1 HPLC chromatogram of two solutions

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取“2.1.1”项下对照品储备液1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0 mL置10 mL量瓶中,加流动相稀释至刻度摇匀,得一系列浓度的标准溶液。分别取20μL进样测定,记录色谱图[3]。以峰面积(A)为纵坐标,以浓度(C,mg·mL-1)为横坐标绘制标准曲线,得回归方程(n=7):A=1×108C-4.18×104,r=0.999 7。结果表明,3-酰胺基-吲哚类衍生物在0.04～0.16 mg·mL-1浓度范围内与峰面积呈良好线性。

2.3.2 重复性实验 分别取供试品(批号: 20121011)6份及对照品2份,精密称定,照“2.2”项操作,按外标法以峰面积计算样品含量,含量分别为100.8%,101.3%,101.5%,101.4%,102.0%, 101.5%,平均含量为101.3%,RSD为0.52%。

2.3.3 检测限与定量限 精密吸取“2.1.1”项对照品储备液,加流动相逐级稀释,进样,记录色谱图,在信噪比(S/N)为3∶1时测得检测限为2.65 ng,在S/N为10∶1时测得的定量限为10.6 ng。

2.3.4 样品含量测定 按“2.1”项的方法分别制备对照品溶液和供试品溶液,各取20μL进样,按外标法以峰面积计算样品含量,结果表明,3批样品主峰含量均＞99.0%(表1)。

表1 3批样品的含量及有关物质测定Tab.1 Content determ ination and related substances of 13 batches of sam p les %,n=3

2.3.5 有关物质测定 取“2.1.3”项的供试品储备液,精密移取此溶液适量,用流动相稀释100倍,得自身对照溶液。以不加校正因子主成分自身对照法计算有关物质的含量。结果表明,有关物质均＜1%(表1)。

2.3.6 方法专属性考察

2.3.6.1 酸破坏 取“2.1.3”项供试品储备液2 mL置10 mL量瓶中,加1 mol·L-1盐酸3 mL,静置15 h,用1 mol·L-1氢氧化钠中和,加流动相稀释至刻度摇匀,作为酸破坏样品,照“2.2”项色谱条件,取20μL进样,记录色谱图。见图2。

2.3.6.2 碱破坏 取“2.1.3”项供试品储备液2 mL置10 mL量瓶中,加1 mol·L-1氢氧化钠3 mL,静置17 h,用1 mol·L-1盐酸中和,加流动相稀释至刻度摇匀,作为碱破坏样品,照“2.2”项色谱条件,取20μL进样,记录色谱图。见图3。

2.3.6.3 氧化破坏 取“2.1.3”项下供试品储备液2 mL置10mL量瓶中,加30%过氧化氢溶液3mL,静置12 h,加流动相稀释至刻度摇匀,作为氧化破坏样品,照“2.2”项的色谱条件,取20μL进样,记录色谱图。见图4。

1.3-酰胺基-吲哚类衍生物图2 供试品溶液酸破坏实验的HPLC色谱图1.3-amido-indole derivativesFig.2 HPLC chromatogram of the sam p le solution in acid damage experim ent

1.3-酰胺基-吲哚类衍生物图3 供试品溶液碱破坏实验的HPLC色谱图1.3-amido-indole derivativesFig.3 HPLC chromatogram of the sam p le solution in base damage experim ent

2.3.6.4 高温破坏 取供试品适量,平铺于干净的称量瓶内,敞口放置于120℃烘箱内,3 h后取出放至室温,称取供试品10 mg,精密称定,置25 mL量瓶中,加流动相稀释至刻度摇匀,作为高温破坏样品,照“2.2”项的色谱条件,取20μL进样,记录色谱图。见图5。

结果表明供试品经酸、碱、氧化、高温破坏后,所建立的高效液相色谱法能够使3-酰胺基-吲哚类衍生物与有关物质较好分离,说明该方法专属性好。

3 讨论

3.1 波长的选择 经二极管阵列全波长扫描,得主峰的最大吸收波长为224.0 nm,有关物质的最大吸收在225.2 nm,因此选择224 nm作为检测波长。

1.3-酰胺基-吲哚类衍生物图4 供试品溶液氧化破坏实验的HPLC色谱图1.3-amido-indole derivativesFig.4 HPLC chromatogram of the sample solution in oxidative damage experiment

1.3-酰胺基-吲哚类衍生物图5 供试品溶液高温破坏实验的HPLC色谱图1.3-amido-indole derivativesFig.5 HPLC chromatogram of the sam p le solution in high temperature damage experiment

3.2 流动相的选择 考察了甲醇-水系统作为流动相,在甲醇∶水=55∶45时,主药与有关物质分离良好,但在此条件下考察高温破坏样品时,主峰与新破坏出的杂质峰未分开,为缩短分析时间及改善分离度,加入乙腈进行调节,经摸索进行比例调节,最终确定甲醇、乙腈和水的比例为43∶12∶45。

[1] 王祖承.精神病学[M].北京:人民卫生出版社,2002: 112-125.

[2] KENNEDY SH.A review of antidep ressant treatments today [J].Eur Neuro Pharm,2006,165(4):619-624.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:附录195.

DOI 10.3870/yydb.2014.05.031

Determination of Contents 3-amide-indole Derivative and Related Substances

SHEN Dong-ni,YANG Jian-yun,XIAO Bing-kun,HUANG Rong-qing
(Institute of Radiation Medicine, Academy ofMilitary Medical Science,Beijing 100850,China)

ObjectiveTo establish a RP-HPLC method for the determination of 3-amide-indole derivative and its related substances.MethodsDiamonsil C18(250 mm×4.6mm,5μm)column was adopted.Themobile phase consisted of a mixture ofmethanol-acetonitrile-water(43∶12∶45)at the flow rate of 1.0 mL·m in-1.The wavelength for ultraviolet detection was 224 nm.The injection volume was 20μL and the column temperature was room temperature.Results3-amide-indole derivative and related substances could be well separated.The linearity of the 3-amide-indole derivative curve waswell correlated (r=0.999 7)within the range of 0.04-0.16 mg·mL-1.The RSD was 0.52%with good repeatability.The detection limitwas 2.65 ng.ConclusionThemethod is accurate,reliable,sensitive and specific,which can be used for the determination of 3-amide-indolederivative and related substances.

3-amide-indole derivative;Chromatography,high performance liquid;Contents determination

R971.43;R927.2

A

1004-0781(2014)05-0650-03

2013-03-05

2013-05-07

*国家自然科学基金项目(81072613)；“十二五”国家科技重大专项“重大新药创制”综合性新药研究开发技术大平台(2012ZX09301003-001-010)

申冬妮(1980-),女,山西太原人,主管药师,在读硕士,研究方向:药物分析。电话:(0)18190690827,E-mail:sdn2005@gmail.com。

黄荣清(1965-),男,江西人,研究员,研究方向:新药质量标准。电话:010-66930217,E-mail:huangrq@tom.com。