桦褐孔菌多糖对抗结核药物所致肝损伤小鼠的保护作用*

钟秀宏,杨淑艳,赵丽微,郑中华,张以忠,王爽,钟越,郭敏,杨宁江

(1.吉林医药学院病理教研室,吉林 132013；2.吉林医药学院附属医院,吉林 132013)

桦褐孔菌多糖对抗结核药物所致肝损伤小鼠的保护作用*

钟秀宏1,杨淑艳1,赵丽微1,郑中华1,张以忠1,王爽1,钟越1,郭敏2,杨宁江2

(1.吉林医药学院病理教研室,吉林 132013；2.吉林医药学院附属医院,吉林 132013)

目的 探讨桦褐孔菌多糖对异烟肼和利福平合用所致肝损伤小鼠的保护作用及其机制。方法48只小鼠随机分为对照组,模型组,护肝片组,桦褐孔菌多糖低、中和高剂量组共6组,每组8只。除对照组外,其余各组每天采用异烟肼和利福平灌胃造成肝损伤模型,2 h后,对照组和模型组分别予以等体积0.9%氯化钠溶液灌胃,其余各组分别予以护肝片、桦褐孔菌多糖灌胃,连续2周。分别检测各组小鼠肝指数和血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性,肝组织匀浆丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性,并做肝组织病理学检查。结果桦褐孔菌多糖低、中、高剂量组和护肝片组肝指数、血清ALT和AST活性、肝匀浆MDA含量均明显降低,肝匀浆SOD的活性显著提高。桦褐孔菌多糖低、中、高剂量组肝细胞变性和坏死程度明显减轻,肝组织的病理改变缓解。结论桦褐孔菌多糖对异烟肼和利福平所致肝损伤小鼠具有明显的保护作用,其机制可能与其抗氧化作用有关。

桦褐孔菌多糖;异烟肼;利福平;损伤,肝;保护作用

异烟肼和利福平是目前抗结核病常用的一线药物,但二者合用肝毒性发生率增加[1-3],严重影响了患者的健康和抗结核病的疗效。因此寻找既能增强异烟肼和利福平疗效,又能对抗其不良反应的药物,显得很有必要。研究表明,桦褐孔菌具有免疫调节、抗癌及阻止肿瘤转移、抗炎、调整血脂、抗脂质过氧化等功效[4],其抗氧化和降低血脂的作用正日益受到关注。桦褐孔菌通过抗脂质过氧化反应对化学性肝损伤有一定的保护作用[5],但对抗结核药致肝损伤的保护作用笔者未见报道。笔者在本实验中通过观察异烟肼和利福平联合用药致肝损伤小鼠在给予桦褐孔菌多糖前后各指标的变化,探讨桦褐孔菌对异烟肼和利福平致肝损伤的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级小鼠48只,雌雄各半,体质量20～25 g,购自吉林大学实验动物中心,动物许可证号: SCXK(吉)2008-0005。环境温度(22±2)℃,自由摄食与饮水。

1.2 药品与试剂 异烟肼片(规格:每片0.1 g,山西太原药业有限公司,批号:090101)；利福平胶囊(规格:每粒0.15 g,沈阳红旗制药有限公司,批号:1001131)；护肝片(吉林省罗邦药业有限公司,批号:20080505),使用时用0.9%氯化钠溶液溶解,配制相应浓度。丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)试剂盒(潍坊三维生物工程有限公司,批号:100401),考马斯亮蓝测定试剂盒(南京生物制品研究所,批号:20100428)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。其他试剂均用国产分析纯。桦褐孔菌精制多糖(纯度98%)由河南大学药学院赵芬琴博士制备并提供。

1.3 仪器 ZMN-7803型全自动组织包埋机,常州市华利电子有限公司生产；TD5A型台式低速离心机,湖南凯达科学仪器有限公司生产；AG135电子分析天平,上海精密科学仪器有限公司生产；电热恒温水浴锅,北京医疗设备厂生产；SelectraXL型全自动生化分析仪,荷兰威图仪器有限公司生产；722型紫外分光光度计,上海欣茂仪器有限公司生产。

1.4 方法

1.4.1 抗结核药致小鼠急性肝损伤模型的制备与药物处理 小鼠适应性喂养饲养1周后,雌雄分开,采用随机分组法将其分为对照组,模型组,护肝片组,桦褐孔菌低、中、高剂量组,共6组,每组8只。除对照组外,其余5组小鼠一次性灌胃异烟肼和利福平各75 mg·kg-1·d-1,灌胃体积为20 m L·kg-1,以造成肝损伤模型[6],对照组则灌胃等体积0.9%氯化钠溶液。在给予异烟肼和利福平2 h后,护肝片组给护肝片1 400 mg·kg-1·d-1,桦褐孔菌多糖低、中和高剂量组分别灌胃100,200,400 mg·kg-1·d-1桦褐孔菌多糖,正常组和模型组均灌胃等体积0.9%氯化钠溶液,各组灌胃体积均为20 mL·kg-1,连续给药2周。

1.4.2 标本采集 全部小鼠末次给药禁食不禁水16 h后,称体质量,摘眼球取血,制备血清后检测ALT和AST活性。迅速取肝称质量,然后取相同部分肝叶置于10%甲醛溶液固定,部分肝制成10%肝组织匀浆液,4 000 r·min-1离心10 min,取适量上清液,进行MDA、SOD和GPx含量测定。

1.4.3 指标检测 ①肝指数及形态学观察:计算肝指数(肝质量/小鼠质量×100%),取部分肝叶固定,包埋,切片,染色,进行肝形态学观察。②ALT和AST活性测定:摘取眼球取血,用全自动生化分析仪测定AST、ALT水平。③肝匀浆MDA、SOD和GPx含量测定:按试剂盒说明进行操作。

1.5 统计学方法 采用SPSS14.0版统计学软件进行数据分析。数据用均数±标准差()表示,组间比较用方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 桦褐孔菌多糖对抗结核药所致肝损伤小鼠肝指数的影响 对照组,模型组,护肝片组,桦褐孔菌低、中、高剂量组小鼠肝指数分别为(5.37±0.27)%, (6.39±0.54)%,(5.55±0.26)%,(5.45±0.25)%, (5.52±0.27)%,(5.65±0.24)%。与对照组比较,模型组肝指数增加(P＜0.01)；与模型组比较,桦褐孔菌低、中、高剂量组肝指数均降低(均P＜0.01)。

2.2 桦褐孔菌多糖对抗结核药所致肝损伤病理形态学的影响 光镜下,对照组肝细胞结构正常,肝细胞索清晰,围绕中央静脉呈放射状排列:模型组可见肝小叶排列整齐,大部分肝细胞水肿变性加重,肝窦受压变窄,有气球样变,嗜酸性变,点状坏死病灶,并见炎细胞浸润,与模型组比较,各给药组病理改变改善明显,水肿变性减轻,桦褐孔菌多糖组以高剂量为显著。结果见图1。

2.3 桦褐孔菌多糖对抗结核药所致肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响 见表1。与对照组比较,模型组ALT和AST的活性增加(P＜0.01)。与模型组比较,桦褐孔菌低、中、高剂量组ALT和AST的活性均降低(均P＜0.01)。

2.4 桦褐孔菌多糖对抗结核药所致肝损伤小鼠肝匀浆中MDA、SOD和GPx的影响 与对照组比较,模型组MDA的含量升高(P＜0.01)。与模型组比较,桦褐孔菌多糖各剂量组MDA的含量均降低(P＜0.05或P＜0.01)。与对照组比较,模型组SOD的含量降低(P＜0.01)。与模型组比较,桦褐孔菌多糖各剂量组SOD的含量均降低(均P＜0.01)。与对照组比较,模型组GPx的含量降低(P＜0.01)。与模型组比较,桦褐孔菌多糖各剂量组GPx的含量均升高(均P＜0.01)。结果见表2。

3 讨论

血清中AST和ALT是用于诊断肝实质损害的主要酶类[7-8]。本实验中,从形态学和血清学检查可以看出,模型组小鼠肝细胞变性坏死,血清AST和ALT升高,均提示小鼠肝细胞已经发生损伤,模型复制成功。桦褐孔菌多糖组与模型组比较,小鼠肝细胞变性坏死程度明显减轻,血清AST和ALT明显降低,表明桦褐孔菌多糖对抗结核药引起的肝细胞膜结构和功能的破坏具有保护作用,能提高细胞膜稳定性。

A.对照组;B.模型组;C.护肝片组;D.桦褐孔菌低剂量组;E.桦褐孔菌中剂量组;F.桦褐孔菌高剂量组图1 6组小鼠肝组织病理形态学比较(×100)A.the control group；B.the model group；C.hugan tablet group；D.low dose of inonotus obliquus group；E.middle dose of inonotus obliquus group；F.high dose of inonotus obliquus groupFig.1 Com parison of hepatic pathomorphology among six groups ofmice(×100)

表1 6组小鼠血清ALT和AST比较Tab.1 Comparison of ALT and AST in serum among six groups of mice U·L-1,

表1 6组小鼠血清ALT和AST比较Tab.1 Comparison of ALT and AST in serum among six groups of mice U·L-1,

与对照组比较,*1P＜0.01;与模型组比较,*2P＜0.01Compared with the control group,*1P＜0.01;compared with the model group,*2P＜0.01

组别小鼠/只剂量/ (mg·kg-1)ALT AST对照组8…49.67±7.64 69.83±10.11模型组8…208.80±116.26 106.28±17.30*1护肝片组8 1 400 62.25±9.43 76.16±10.02*2桦褐孔菌多糖低剂量组8 100 67.65±9.86 87.23±9.21*2中剂量组8 200 61.56±5.65 79.23±15.01*2高剂量组8 400 50.05±3.32 74.83±13.00*2

异烟肼和利福平致肝损伤机制目前认为是利福平诱导了肝药酶,加速了乙酰异烟肼代谢为乙酰肼,而其代谢物乙酰肼可通过酶系统与非酶系统产生自由基,进而攻击生物膜中的不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化作用,并因此形成包括MDA在内的脂质过氧化物。MDA是脂质过氧化反应的终产物,既能反映体内脂质过氧化的水平,也能作为机体损伤的损伤因子。实验结果显示:模型组与对照组比较,肝组织中MDA含量升高；桦褐孔菌多糖组与模型组比较,肝组织中MDA含量减低,进一步证明脂质过氧化与肝损伤的发病机制有关,也说明桦褐孔菌多糖有抗损伤的作用,此作用可能与抑制或清除自由基有关。

SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要作用,能清除超氧阴离子自由基(O2-)保护细胞免受损伤,间接反映了机体清除自由基的能力；GPx是机体内广泛存在的一种含硒抗氧化酶,可通过特异性催化谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应,而清除细胞内有害的过氧化代谢产物,以阻断脂质过氧化连锁反应,从而对细胞代谢的正常进行起到重要作用。本实验中,模型组SOD和GPx明显降低,桦褐孔菌多糖各剂量组SOD和GPx较模型组明显升高,呈剂量效应关系。由此推断,桦褐孔菌多糖可能是通过提高SOD和GPx活性,增强内源性氧自由基清除系统的功能,减少由氧自由基作用膜脂质生成的脂质过氧化物MDA引起的肝损伤,对抗结核药引起的药物性肝损伤有一定的防治效果。

表2 6组小鼠肝匀浆中M DA、SOD和GPx的含量比较Tab.2 Comparison of the contents of M DA,SOD and GPx in liver homogenate among six groups of mice

表2 6组小鼠肝匀浆中M DA、SOD和GPx的含量比较Tab.2 Comparison of the contents of M DA,SOD and GPx in liver homogenate among six groups of mice

与对照组比较,*1P＜0.01;与模型组比较,*2P＜0.05,*3P＜0.01Compared with the control group,*1P＜0.01;compared with the model group,*2P＜0.05,*3P＜0.01

组别小鼠/只剂量/ (mg·kg-1) MDA/ (nmol·mg-1) SOD/ (U·mg-1) GPx/ (μmol·L-1)对照组8…0.91±0.19 118.27±9.41 3.67±0.45模型组8 1.12±0.11*192.56±9.10*12.17±0.51*1护肝片组8 1 400 0.95±0.15*2108.14±9.93*33.56±0.72*3桦褐孔菌多糖低剂量组8 100 1.08±0.13*2110.81±4.31*33.63±0.67*3中剂量组8 200 0.99±0.14*3113.88±5.01*33.78±0.76*3高剂量组8 400 0.93±0.12*3116.88±4.01*33.88±0.65*3

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DOI 10.3870/yydb.2014.05.002

Protective Effects of Inonotus Obliquus Polysaccharide on Liver Injury Induced by Antituberculosis Drugs in Mice

ZHONG Xiu-hong1,YANG Shu-yan1,ZHAO Li-wei1,ZHENG Zhong-hua1,ZHANG Yi-zhong1,WANG Shuang1,ZHONG Yue1,GUO Min2,YANG Ning-jiang2
(1.Department of Pathology,College of Pharmacy, Jilin Medical College,Jilin 132013,China;2.Affiliated Hospital of Jilin Medical College,Jilin 132013,China)

ObjectiveTo study the protective effect and mechanism ofInonotus obliquuspolysaccharide on liver injury induced by isoniazid(INH)combined with rifampicin(RFP)inmice.MethodsForty-eightmicewere randomly divided into six groups(control,model,hugan pian,Inonotus obliquuspolysaccharide at low,middle,and high dose).Themice were administered orally with isoniazid and rifampicin simultaneously except the control.After2 h,the control andmodel groupswere administered with normal saline,and others were treated withhugan pianandInonotus obliquuspolysaccharide,respectively,once a day for 2 weeks. The liver index and serum levels of ALT and AST,malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase (GPx)weremeasured.Pathology examination of liver tissue was performed.ResultsThe activities of ALT and AST,liver index, content ofMDA in liver homogenate of mice treated withInonotus obliquuspolysaccharide andhugan piandecreased obviously,while the liver SOD activity increased.Histopathological exzamination showed thatInonotus obliquuspolysaccharide alleviated the degeneration and necrosis of hepatic cells.ConclusionInonotus obliquuspolysaccharide shows protective effects on mice with hepatic toxic injury induced by isoniazid and rifampicin,which maybe due to its antioxidation effect.

Inonotus obliquuspolysaccharide;Isoniazid;Rifampicin;Injury,liver;Protective effect

R975.5;R285.5

A

1004-0781(2014)05-0558-04

2013-06-28

2013-08-20

*吉林省卫生厅基金资助项目(2012zc018)；吉林市科技发展计划项目(201032242)

钟秀宏(1971-),女,畲族,浙江金华人,副教授,硕士,主要从事中药防护研究工作。电话:(0) 15144288179,E-mail:xhzhong0611@163.com。

杨宁江(1963-),男,吉林人,教授,硕士,主要从事病理形态学研究。电话:(0)13944272845,E-mail:yangningjiang465@163.com。