毛细管固相微萃取-液质联用测定血浆中5种新型滥用药物*

王毅,刘子秋

(贵阳市公安司法鉴定中心,贵阳 550007)

毛细管固相微萃取-液质联用测定血浆中5种新型滥用药物*

王毅,刘子秋

(贵阳市公安司法鉴定中心,贵阳 550007)

目的 建立毛细管固相微萃取-超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法测定血浆中新型滥用药物。方法取含药物成分的血浆样品1 m L,加入硼砂缓冲液2 mL后吸入注射器中,与内壁固定有DB-1701毛细管柱的不锈钢针头连接,置于注射泵,以300μL·min-1流速排出样品,乙腈50μL洗脱2min,采用UPLC-MS/MS梯度洗脱-正离子多反应监测扫描测定洗脱液中药物成分,并对实际样品进行检验。结果血浆中盐酸可待因、盐酸曲马多、地芬诺酯、地西泮、三唑仑等5种新型滥用药物回收率为69.2%～81.7%,RSD＜10%,检测限＜25 ng·mL-1,26例样品中检出7例。结论采用毛细管固相微萃取方法简便,快速,与UPLC-MS/MS技术结合可用于血浆中新型滥用药物的快速筛查。

毛细管固相微萃取;液质联用;滥用药物,新型;血浆

止咳水、盐酸曲马多片、复方地芬诺酯片处方制剂中主要含有可待因、曲马多、地芬诺酯等精神类药物成分,近年来在青少年中滥用的情况越发严重,首用年龄由16岁降至约14.5岁,合并地西泮、三唑仑使用更易造成依赖,甚至死亡。对血浆中该类新型滥用药物的筛查分析已成为法医毒物检验的新关注点[1]。现有检验方法例如液-液提取[2]、固相萃取法[3]所耗时间长、有机试剂用量大、成本高。而毛细管固相微萃取(in-tube solid-phasemicroextraction,In-tube SPME)技术操作简便、快捷,污染小[4],便于在线联用[5-6],在药物筛查方面具有良好的应用前景。笔者通过建立In-tube SPME-超高效液相色谱-串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)联用法测定血浆中新型滥用药物,并对实际样品进行检验,以提高检测效率和准确度。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UPLC-TQD三重四级杆串联质谱仪(美国Waters公司)；DB-1、DB-5、DB-1701、HP-INNOWax毛细管色谱柱(美国J&W公司)；实验室注射泵(LSP01-1A,兰格公司)；20-gauge不锈钢针头,鲁尔头进样器(上海光正医疗仪器有限公司)。

1.2 试药 盐酸可待因、盐酸曲马多、地芬诺酯、地西泮、三唑仑标准品(公安部物证鉴定中心)；内标为3,4-亚甲二氧甲基苯丙胺(DL-3,4-methylenedioxymethamphetamine,DLMDMA,美国Aldrich公司)；甲醇、乙腈为色谱纯(美国Tedia公司)；超纯水。

2 方法与结果

2.1 标准溶液制备 准确称取标准品和内标,分别用甲醇配制成1 mg·m L-1标准储备液,然后稀释配制成20μg·m L-1的混合标准品溶液。

2.2 样品溶液制备 取空白血浆,添加适量混合标准品溶液,制得药物浓度为100 ng·mL-1的混标血浆样品；In-tube SPME装置的不锈钢针头内表面依次用1 mol·L-1盐酸、乙腈清洗。截取10 cm毛细管柱,表面涂布环氧胶,放入不锈钢管内,制得In-tube SPME针头,晾干4 h后备用。

萃取:取血浆1 m L,加入缓冲液2 mL,漩涡混匀,离心,注射器抽取上清液后更换In-tube SPME针头,置于注射泵以一定流速排出样品,完成萃取过程。

解吸:用水1 m L洗去In-tube SPME针头中残留样品后,针头换至含乙腈50μL的鲁尔头进样器上,置于注射泵以一定流速排出乙腈,使目标物从固定相中洗脱出来,完成解吸。

2.3 测定条件 Waters UPLC-TQD；色谱柱:Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm),柱温:30℃,流动相:乙腈(A相)-0.1%甲酸(B相)梯度洗脱,梯度洗脱程序:A相5%保持2 min,从5%经15 min升至25%,再从25%经3 min升至100%,保持1.5 min；流速:0.3mL·min-1；进样体积5μL。质谱条件:采用电喷雾电离源,毛细管电离电压:3 kV,离子源温度: 120℃；喷雾气与反吹气:氮气,去溶剂气流速: 650 L·h-1,多反应离子监测。

2.4 萃取条件优化

2.4.1 毛细管萃取柱的选择 不同填料对血浆中药物成分的萃取能力不同,实验在一定条件下对DB-1、DB-5、DB-1701、HP-INNOWax毛细管柱的萃取效率进行考察,结果(图1A)表明DB-1701色谱柱表现出最优的效果。

2.4.2 基底pH影响 实验考察了5种pH(间隔1.5)基底对样品萃取效率影响(pH＞9时环氧胶易漏液,不作考虑)。结果(图1B)表明,在pH8.5基底环境下效率最佳。

2.4.3 萃取流速的考察 为考察不同流速对萃取效率的影响,实验采用100,300,500μL·min-13个流速进行考察,结果(图1C)显示实验范围内流速变化对萃取效率的影响并不显著,实验选用300μL·min-1作为萃取流速。

A.毛细管萃取柱的选择;B.pH优化;C.流速优化;D.解吸时间优化图1 毛细管固相微萃取条件优化A.the optimization of capillary-column；B.optimization of sample pH on extraction efficiency；C.optimization of flow rate；D. optimization of desorption timeFig.1 Optim ization of extract condition of in-tube SPME

2.4.4 解吸时间的考察 In-tube SPME仅使用数微升有机溶剂即可完成萃取,实验采用50μL乙 腈在5个不同时间段对解吸效率进行考察,曲线表明(峰面积按比例缩小),在1～2 min时提取效率大幅增加,但在2 min后无明显变化(图1D)。

2.5 专属性 取空白血500μL,按“2.2”项操作,获得空白样品多重反应检测(multiple reactionmonitoring, MRM)提取色谱图2A；取混标血浆样品,同法操作获得混标添加MRM提取色谱图2B。结果表明血中内源性物质不干扰待测成分测定。

A.空白溶液;B.样品溶液图2 两种溶液的In-tube SPME-UPLC-MS/MS色谱图A.blank solution；B.sample solutionFig.2 Chrom atogram of in-tube SPME-UPLC-MS/MS for two k inds of solutions

2.6 加样回收率实验 取混标血浆样品(n=6),按“2.2”项操作,获得相应峰面积(A样)；另取全血样品,同法操作,获得空白基质溶液,加入相同浓度的标准工作液,进样分析获得相应峰面积(B样)；以A样与B样峰面积之比计算提取回收率,结果见表1,药物回收率69.2%～81.7%。

2.7 方法检测限 配制质量浓度逐渐降低的系列人血样品,按“2.2”项方法操作后进样分析,记录峰面积,测得药物检测限(S/N=3),结果显示(表1)均低于国际法庭毒理协会报告数据。

2.8 重复性 取混标血浆样品(n=6),按“2.2”项下操作,测定峰面积并计算,结果RSD＜10%,说明方法重复性良好。

2.9 样品测定 对26例非正常死亡青少年血浆进行滥用药物筛查,检出7例(表2),其中3例在服用药物后1 h内发生死亡,其余4例均发生在1～3 h,血浆筛查结果表明混合服用药物可能是造成迅速死亡的直接原因。

3 讨论

色谱柱常用内径分别为0.25,0.32,0.53 mm,内部容积分别为4.91,8.04,20.58μL,选用容积较小的毛细管在一定流速下可以减少管壁液膜层厚度,在非平衡动态吸附方式下对萃取富集和解吸洗脱均有良好效果；且固定相萃取量与血浆中目标物浓度存在线性关系,与血浆体积无关,则固定相厚度增加,萃取量增加,但当厚度接近1μm时,可观察到残留增加,选用膜厚0.5μm为佳。

实验中对于萃取流速考察与FAN等[7]的研究结果相反。考虑虽然增加流速,导致柱体内“对流”效应上升,从而使血浆通过管体时湍流雷诺数加大,但不同大小分子的扩散速度不同,此时萃取效率仅与液膜表面作用力和液膜下固定相表面吸附力有关,因此流速增大未改变萃取效率。另外,500μL·min-1产生明显气泡,故实验选用300μL·min-1作为萃取流速。

受毛细管内壁填料绝对量影响,In-tube SPME不具备良好的线性关系,目前研究多为定性筛查使用[8],实验未对线性进行考察。且当样本浓度＞200 ng·mL-1时可观察到地芬诺酯、地西泮、三唑仑发生明显“泄漏”,采用100 ng·mL-1浓度进行回收率考察等实验内容符合国际毒理学家协会(The International Association of Forensic Toxicologists,TIAFT)要求。

表1 血浆中药物回收率、相对保留时间及检测限Tab.1 Recoveries of drugs in p lasma and their relative retention tim e(RRT)and LOD n=6

表2 7例非正常死亡青少年血浆样品筛查结果Tab.2 Determ ination result of p lasma sam p le from seven youngsters of abnormal death

In-tube SPME技术近来发展很快,结合UPLC-MS/ MS对血浆中新型滥用药物进行筛查,相比其他方法[2],环境友好,操作简便,易自动化,且方法回收率及重复性良好[9],可运用于实际案例筛查分析。在将来的工作中采用该方法进一步扩大药物筛查范围,将成为法医毒物检验的常用手段。

[1] 张锐敏.我国药物滥用防治工作现状分析及未来策略思考[J].中国药物滥用防治杂志,2013,19(2):68-71.

[2] 沈敏,向平,沈保华,等.LC-MS/MS多反应监测筛选分析血液中132种毒药物[J].中国司法鉴定,2006,22(1): 14-20.

[3] 杨志勇,王占良,张建丽.气相色谱-质谱联用快速筛查尿样中麻醉剂类药物[J].质谱学报,2012,33(3):161-167.

[4] YAN X,WU D,PENG H,et al.Array capillary in-tube solidphasemicroextraction:a rapid preparation technique forwater samples[J].JChroma A,2012,1244(1):69-76.

[5] YU QW,WANG X,MA Q,et al.Automated analysis of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in human plasma and water samples by in-tube solid-phase microextraction coupled to liquid chromatography-mass spectrometry based on a poly(4-vinylpyridine-co-ethylene dimethacrylate)monolith[J].AnalMethods,2011,4(6):1538-1545.

[6] MOLINER M Y,PRIMA G H,RIBERA A,et al.Magnetic in tube solid phase microextraction[J].Anal Chem,2012,84 (16):7233-7240.

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DOI 10.3870/yydb.2014.05.007

Determination of 5 New Abused Drugs in Plasma by In-tube Solid-phase Microextraction Coupled to Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

WANG Yi,LIU Zi-qiu
(Judicial Expertise Center ofGuiyang Public Security Bureau,Guiyang 550007,China)

ObjectiveTo establish a method for determination of new abused drugs in plasma by using ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)combined with in-tube solid-phase microextraction.Methods2mL of borax bufferwasadded to1mLofplasmawith drugs.Then,themixturewaswithdrawn into a syringe connected to a stainless steel needle welded with DB-1701 capillary column.50μL acetonitrile was used as elution solventat the flow rate of 300μL·min-1for 2min.Subsequently,the drugs on elutewere determined by using UPLC-MS/MS in positivemodewithmultiple reactionmonitoring(MRM)to determine drug concentration in human plasma samples.ResultsThe recoveries rates of the five abused drugs(codeine hydrochloride,tramadol,diphenoxylate hydrochloride,diazepam,and triazolam)in plasma were between 69.2%-81.7%with the RSDs less than 10%.LODs of the drugs were less than 25 ng·mL-1.Seven out of the 26 plasma samples were determ ined positive.ConclusionThe in-tube SPME method coupled to UPLC-MS/MS is simple,rapid,and environmental friendly,which is suitable for the the rapid screening of the new abused drugs.

In-tube solid-phase microextraction;Liquid chromatography tandem mass spectrometry;Abused drugs, new type;Plasma

R971;R969.1

A

1004-0781(2014)05-0575-04

2013-07-10

2013-09-21

*贵阳市科技计划项目:筑科合同[2012103]98号；贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目[(2011)23号]

王毅(1982-),男,湖南长沙人,工程师,硕士,从事法医毒物检验工作。电话:0851-6797740,E-mail:18712664@qq.com。