月光花豆乙醇提取物对急性肺损伤大鼠的保护作用

唐秀能,韦红棉,黄仁彬

(1.广西医科大学药理学教研室,南宁 530021；2.广西中医药大学附属瑞康医院,南宁 530011)

月光花豆乙醇提取物对急性肺损伤大鼠的保护作用

唐秀能1,2,韦红棉1,黄仁彬2

(1.广西医科大学药理学教研室,南宁 530021；2.广西中医药大学附属瑞康医院,南宁 530011)

目的 探讨月光花豆乙醇提取物(CABE)对急性肺损伤(ALI)大鼠的保护作用。方法大鼠尾静脉注射脂多糖5 mg·kg-1复制ALI模型,免疫组化法测定大鼠肺组织中核因子-κBp65(NF-κB p65)的表达,酶联免疫吸附(ELISA)法测定肺组织白细胞介素-1β(IL-1β)的含量,同时观察肺组织病理形态、肺组织的湿干质量比例(W/D)和肺组织髓过氧化物酶(MPO)的活性。结果模型大鼠和CABE治疗大鼠肺组织W/D分别为5.05±0.24,4.35±0.21;IL-1β含量分别为(320.60±19.73),(294.42±13.95)pg·mL-1;MPO活性分别为(1.31±0.18),(1.04±0.18)U·g-1;与模型大鼠比较,CABE治疗大鼠肺组织损伤减轻,IL-1β含量减少,肺组织W/D和MPO活性降低,NF-κB p65表达降低(P＜0.01)。结论CABE对脂多糖诱导的ALI大鼠具有明显的保护作用,干扰NF-κB途径和抑制IL-1β的生成可能是其作用机制之一。

月光花豆乙醇提取物;损伤,肺,急性;核因子;白细胞介素

月光花(Calonyction aculeatum)属于旋花科(Convolvulaceae)一年生缠绕草本植物,主要分布于陕西、江苏、浙江、江西、广东、广西、云南等地。月光花豆是月光花的朔果,有舒筋活络、消肿镇痛、活血化淤之功效,民间用于腰腿痛、风湿痛、月经痛、软组织损伤等的治疗,有较好疗效。本课题组在前期药效学实验中发现月光花豆乙醇提取物(ethanol extract of calonyction acculeatum beans,CABE)能显著抑制二甲苯致小鼠耳廓水肿反应、醋酸诱发小鼠毛细血管通透性增高、角叉菜胶致大鼠和小鼠足肿胀程度及小鼠棉球肉芽肿生长,显示有较好的抗炎作用。笔者在本实验中通过研究CABE对急性肺损伤(acute lung injury, ALI)的保护作用,进一步研究其抗炎作用,为月光花的开发和利用提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠,SPF级,体质量(200±20)g,动物许可证号:SCXK(桂)2009-0002,由广西医科大学医学实验动物中心提供。

1.2 药品与试剂 CABE由广西医科大学药理教研室提供(CABE的制备:月光花豆适量粗粉碎,加10倍量70%乙醇,浸泡12 h后回流提取2 h,待冷却后过滤,留第1次滤液；取第1次药渣加8倍量70%乙醇,回流提取2 h,待冷却后过滤,留第2次滤液。取第2次药渣加8倍量70%乙醇,回流提取2 h,待冷却过滤。合并3次滤液,于水浴冷却装置回收乙醇。收集提取液并进行减压浓缩,得到浓缩物后,再分别配成所需的相应浓度的CABE)。地塞米松磷酸钠注射液(1 m L∶5 mg),天津药业集团新郑股份有限公司,批号:20101011；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),北京康为生物有限公司,批号:20101108；白细胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)试剂盒,晶美生物工程有限公司,批号:20101013；肺组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)试剂盒,南京建成生物工程研究所,批号:20100506；免疫组织化学方法链霉亲和素-生物素复合物(streptavidin-biotincomplex,SABC)试剂盒,武汉博士德生物工程公司,批号:SA1022。

1.3 LPS致大鼠ALI模型的制备 将32只大鼠随机分为4组,每组8只。模型组灌胃给予0.9%氯化钠溶液,连续7 d,每天1次,末次给药30 min后大鼠尾静脉注射LPS 5 mg·kg-1,6 h后处死；正常组灌胃给予等体积0.9%氯化钠溶液,连续7 d,每天1次,末次给药后30 min后大鼠尾静脉注射等体积0.9%氯化钠溶液,6 h后处死；地塞米松组灌胃给予地塞米松3 mg·kg-1,连续7 d,每天1次,末次给药30 min后大鼠尾静脉注射LPS 5 mg·kg-1,6 h后处死；CABE组灌胃给予CABE(相当于生药3.50 g·kg-1),连续7 d,每天1次,末次给药后30 min后大鼠尾静脉注射LPS 5 mg·kg-1,6 h后处死。所有动物处死后开胸采集肺组织标本[1-3]。

1.4 肺的湿质量/干质量比值(W/D)测定 取出肺脏,迅速剥离左肺,用滤纸吸干表面血渍,分析电子天平称湿质量后置75℃烘烤箱内烘干48 h至恒质量,称干质量,计算肺湿质量/干质量(W/D)值。

1.5 肺组织匀浆MPO活性及IL-1β含量测定 取右肺上叶称质量后匀浆,参照MPO检测试剂盒分析肺组织中MPO的含量。取右肺中叶用0.9%氯化钠溶液制成10%浓度匀浆,匀浆液经3 000 r·min-1离心(r= 12 cm)10 min,取上清液参照酶联免疫吸附试剂盒说明书检测肺组织匀浆中细胞因子IL-1β的含量。

1.6 肺组织病理学检查 取右肺下叶放入中性甲醛溶液固定24 h,70%乙醇脱水、修块、石蜡包埋、切片,苏木精-伊红染色,光镜下观察切片组织的受损等情况。

1.7 核因子(nuclear factor,NF)-κB p65免疫组化检测 取右肺下叶放入中性甲醛溶液固定24 h,70%乙醇脱水,石蜡包埋切片,孵育,抗原热修复,链霉亲和素-生物素标记法进行染色,二氨基联苯胺显色后封片。测定各组肺组织中NF-κB的表达强度。

1.8 统计学方法 应用SPSS15.0版统计学软件进行分析处理,计量资料以均数±标准差()表示,组间比较采用成组t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠W/D、肺组织MPO活性和IL-1β含量与正常组比较,模型组大鼠的肺W/D、肺组织匀浆MPO活性及IL-1β含量均显著增高(P＜0.01)；与模型组比较,地塞米松组、CABE组大鼠肺W/D、肺组织匀浆MPO活性及IL-1β均含量降低(P＜0.01),见表1。

2.2 大鼠肺组织的病理学变化 光镜(10×10)观察:正常组大鼠肺组织结构完整,肺泡清晰,肺泡间隔无水肿及浸润等改变。与CABE组、地塞米松组比较,模型组大鼠肺泡壁完整性破坏严重,肺间质可见大量蓝色炎症细胞浸润(蓝色颗粒为炎性细胞),肺泡间间隔增宽,说明CABE与地塞米松可有效保护LPS诱导的急性肺损伤小鼠,见图1。

2.3 大鼠肺组织的NF-κB p65蛋白表达 经处理后显微镜观察NF-κB p65蛋白阳性反应产物呈棕黄色。正常组NF-κB p65蛋白呈弱阳性或阴性,其阳性反应产物多分布在细胞质中。模型组NF-κB p65蛋白的表达增高,显微镜观察可见细胞质及细胞核内分布均匀的棕黄色颗粒,且大多数已进入细胞核,表明NF-κB p65已活化。地塞米松组、CABE组与模型组比较,棕黄色颗粒明显减少,表明NF-κB p65蛋白的表达下降,见图2。每张切片随机选视野5个(40×10)观察,每个视野细胞100个,计数NF-κB p65阳性细胞个数,取其平均值,计算百分比,结果CABE组、地塞米松组、模型组、正常组肺组织NF-κB p65阳性细胞分别占(45.25± 12.42)%,(47.76±9.96)%,(65.25±8.78)%, (36.98±7.86)%,模型组明显高于正常组(t=3.702,P＜0.01),CABE组和地塞米松组明显低于模型组(t= 3.621,3.615,均P＜0.01)。

表1 4组大鼠肺W/D、MPO活性和IL-1β含量比较Tab.1 Comparison of the wet-dry weight ratio of lung,MPO activity and IL-1βcontent among four groups of rats

表1 4组大鼠肺W/D、MPO活性和IL-1β含量比较Tab.1 Comparison of the wet-dry weight ratio of lung,MPO activity and IL-1βcontent among four groups of rats

与正常组比较,*1P＜0.01;与模型组比较,*2P＜0.01Compared with the normal group,*1P＜0.01;compared with the model group,*2P＜0.01

组别剂量/(g·kg-1)大鼠/只W/D MPO/(U·g-1)IL-1β/(pg·mL-1)正常组…83.96±0.25 0.72±0.11 64.06±7.00模型组…8 5.05±0.24*11.31±0.18*1320.60±19.73*1地塞米松组0.003 8 4.21±0.19*20.99±0.20*2271.61±16.21*2CABE组3.50 8 4.35±0.21*21.04±0.18*2294.42±13.95*2

3 讨论

ALI是各种直接或间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤,主要特征为弥漫性肺间质及肺泡水肿,可导致急性低氧性呼吸功能不全,临床主要表现为急性进行性呼吸困难和难治性低氧血症,是急性呼吸窘迫综合征的一种过渡阶段[4]。大鼠尾静脉注射LPS一直是ALI经典建模方式之一,研究表明,5 mg·kg-1LPS尾静脉注射即可导致ALI[5]。本实验病理结果显示,正常组大鼠肺组织结构完整,肺泡清晰,肺泡间隔无水肿及浸润等改变,而模型组大鼠肺泡壁完整性破坏严重,肺间质可见大量炎症细胞浸润,肺泡间间隔增宽,肺部呈现急性炎症表现,证实本实验ALI模型建立成功。

MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志,是反映组织中炎性反应的重要指标,其水平及活性变化代表着中性多形核白细胞的功能和活性状态[6]。MPO活性则可以判断中性粒细胞在组织中浸润情况。

NF-κB是参与炎症反应重要的转录因子之一,被激活后可诱导多种细胞因子大量表达,在各种细胞外刺激介导的细胞转导调控中起核心作用。在发生ALI的过程中,NF-κB途径是一个极为重要的途径[7-8]。许多炎症因子(如IL-1β)在炎症反应的各个阶段都受NF-κB的调控[9-10]。NF-κB的激活通过NF-κB信号转导通路在第一时间对有害细胞的刺激做出反应,而不需要新翻译出蛋白质进行调控[11-12]。IL-1β作为前炎症细胞因子,含有NF-κB的结合位点,当NF-κB受内外源性刺激由细胞质向细胞核转移并活化后,启动了炎症级联反应,对中性粒细胞及其他炎症细胞聚集、递质释放等炎症过程中起关键作用,导致炎症反应的放大[13]。

A.正常组;B.模型组;C.地塞米松组;D.CABE组图1 4组大鼠肺组织的病理学变化(10×10)A.normal group；B.model group；C.dexamethasone group；D.CABE groupFig.1 Pathological changes of lung tissue among four groups of rats(10×10)

A.正常组;B.模型组;C.地塞米松组;D.CABE组图2 4组大鼠肺组织NF-κB p65蛋白的表达情况(40×10)A.normal group；B.model group；C.dexamethasone group；D.CABE groupFig.2 Expression of NF-κBp65 protein of lung tissue among four groups of rats(40×10)

本研究结果显示,CABE可降低肺组织炎性病变,抑制MPO活性增加,调节炎性细胞因子分泌。模型组大鼠肺组织中NF-κB p65和IL-1β的含量明显升高,而CABE组大鼠肺组织中NF-κB的含量显著减少,同时IL-1β的水平显著降低,可推测CABE可能通过抑制NF-κB信号转导途径的过度激活,进而减少炎性递质IL-1β的合成和释放,是其对ALI的保护作用机制之一。

[1] 解宇环,沈映君,金沈锐,等.荆芥挥发油对急性肺损伤大鼠肺组织病理形态及NF-κB、IκB含量的影响[J].华西药学杂志,2008,23(3):274-276.

[2] FENG Y,YANG Q,XU J,etal.Effects of HMGB1 on PMN apoptosis during LPS-induced acute lung injury[J].Exp Mol Pathol,2008,85(3):214-222.

[3] 赵伟,孙国志.常见实验动随机分组方法[J].畜牧兽医科技信息,2009,15(4):61-62.

[4] ATABAIK,MATT H M.The pulmonary physician in critical care 5:acute lung injury and the respiratory distress syndrome:definitions and epidemiology[J].Thorax,2002, 57(5):452-458.

[5] 杜悦,蔡栩栩,高红,等.内毒素致新生大鼠肺出血肺组织t-PA,PAL-1基因表达的研究[J].新生儿科杂志, 2003,18(2):63.

[6] MORI T,TOWN T,TAN J,et al.Modulation of astrocytic acti-vation by arundic acid(ONO22506)mitigates detrimental effects of the apolipoprotein E4isoform after permanent focal ischemia in apolipoprotein E knock-inmice [J].JCereb Blood Flow Metab,2005,25(6):748-762.

[7] YANG R,YANG L,SHEN X,et al.Suppression of NF-κB pathway by crocetin contributes to attenuation of lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice[J]. Eur JPharmacol,2012,674(2-3):391-396.

[8] KUO M Y,LIAO M F,CHEN F L,et al.Luteolin attenuates the pulmonary inflammatory response involves abilities of antioxidation and inhibition of MAPK and NF-κB pathways in mice with endotoxin-induced acute lung injury[J].Food Chem Toxicol,2011,49(10):2660-2666.

[9] BHATIA M,MOOCHHALA S.Role of inflammatorymediators in the pathophysiology of acute respiratory distress syndrome[J].JPathol,2004,202(2):145-156.

[10] GIEBELEN I A,WESTERLOO D J,LAROSA G J,et al. Local stimulation of alpha7 cholinergic receptors inhibits LPS-induced TNF-alpha release in the mouse lung[J]. Shock,2007,28(6):700-703.

[11] SCHUH K,PAHL A.Inhibition of the MAP kinase ERK protects from lipopolysaccharide-induced lung injury[J]. Biochem Pharmacol,2009,77(12):1827-1834.

[12] YIN H,LI X Y,YUAN B H,et al.Adenovirus-mediated overexpression ofsoluble ST2 provides a protective effecton lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice[J]. Clin Exp Immunol,2011,164(2):248-255.

[13] 王兴友,钱桂生,毛宝玲.急性肺损伤大鼠海马内c-fos基因的表达[J].中国危重病急救医学,2002,14(9): 548-550.

DOI 10.3870/yydb.2014.05.005

Protective Effects of Ethanol Extracts of Calonyction Acculeatum Beans on Rats with Acute Lung Injury

TANG Xiu-neng1,2,WEI Hong-mian1,HUANG Ren-bin2
(1.Department of Pharmacology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of ethanol extract ofcalonyction acculeatumbeans(CABE) on rats with acute lung injury(ALI).MethodsThe ALI model was induced via intravenous injection with 5 mg·kg-1lipopolysaccharide(LPS).The expression ofnuclear factor-κB p65(NF-κB p65)was determind by immunohistochemistry(IHC), and the content of interleukin-1β(IL-1β)in the lung tissue was detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Meanwhile,lung tissue histopathology,the wet-dry weight ratio of lung and the activity of myeloperoxidase(MPO)in the lung tissueswere observed.ResultsThe wet-dry weight ratio of lung of the model group and CABE treatment group was 5.05± 0.24,4.35±0.21,respectively;the content of IL-1βwas(320.60±19.73),(294.42±13.95)pg·mL-1,respectively;the MPO activity was(1.31±0.18),(1.04±0.18)U·g-1,respectively.Compared with the model group,CABE lessened the lung injury,decreased IL-1βlevel,reduced the lung dry-wet weight ratio and activity of MPO,and down-regulated the expression of NF-κB/p65(P＜0.05).ConclusionCABE has remarkedly protective effect on ALI induced by LPS in rats.One of the mechanismsmay be related to reducing the secretion of IL-1βand interfering with the activity of NF-κB.

Ethanol extract ofcalonyction acculeatumbeans;Injury,lung,acute;Nuclear factor;Interleukin

R282.71;R285.5

A

1004-0781(2014)05-0569-04

2013-06-10

2013-09-26

唐秀能(1971-),男,广西都安人,副主任药师,硕士,主要从事临床药学、医院药事管理工作。电话:0771-2188067,E-mail:txnyaoshi2008@163.com。

韦红棉(1976-),女,广西都安人,主管护师,学士,主要从事医院护理工作。电话:0771-2188067,E-mail:whmtyb@163.com。