丹红注射液对SMMC-7721肝癌细胞的促凋亡作用

仲蕾,徐立平,钱先中,金慧静,陈超,仵利军

(解放军第100医院药械科,苏州 215007)

丹红注射液对SMMC-7721肝癌细胞的促凋亡作用

仲蕾,徐立平,钱先中,金慧静,陈超,仵利军

(解放军第100医院药械科,苏州 215007)

目的 研究丹红注射液对SMMC-7721肝癌细胞凋亡的作用。方法将0,2,4,8μL·mL-1丹红注射液分别作用人肝癌细胞系SMMC-7721,在显微镜下观察不同浓度丹红注射液对细胞形态的影响,选择2μL·mL-1作用后,0, 6,12,24 h流式细胞仪检测细胞凋亡指数变化;以噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度丹红注射液对SMMC-7721肝癌细胞增殖的影响;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测p53、Bax、Bcl-2在含不同浓度药物的SMMC-7721细胞中表达。结果随着药物浓度增大,SMMC-7721的凋亡形态越明显,并且随作用时间的延长,细胞凋亡指数也增加;不同浓度丹红注射液对SMMC-7721细胞均有明显的剂量和时间依赖性;不同浓度药物可诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡;随着丹红注射液浓度增加,Bcl-2在SMMC-7721细胞中的表达降低,p53和Bax的表达增高。结论丹红注射液能促进SMMC-7721细胞的凋亡,且具有一定的剂量和时间依赖性。

丹红注射液;SMMC-7721肝癌细胞;凋亡

丹红注射液是将中药丹参、红花按科学配方提取的复方制剂。丹参为唇形科植物,具有活血祛痕、养血安神、调经镇痛、凉血消痈的功效。红花为菊科植物的干燥管状花,具有活血通经、散癖镇痛的功效。研究表明,活血化瘀药物可抑制肝癌细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡,而丹红注射液是常用的活血化瘀药物,故笔者选择此药做进一步研究。丹参主要通过抑制细胞增殖、促进凋亡以及促进分化等机制发挥抗肿瘤作用,对多种肿瘤细胞具有生长抑制作用和分化诱导作用[1]。体外研究表明,丹参类化合物可抑制多种肿瘤细胞增殖,影响细胞周期分布。笔者主要研究丹红注射液对SMMC-7721细胞毒性和细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人肝癌细胞株SMMC-7721由苏州大学细胞与分子教研室提供。细胞培养于RPMI1640 (GIBCO公司)培养液中,含10%灭活小牛血清, 37℃,5%二氧化碳(CO2)。

1.2 药物处理 丹红注射液(10 mL,6支),由菏泽步长制药有限公司生产,批准文号:国药准字Z20026866。细胞按2×105接种于6孔板中,待细胞贴壁后,根据预实验及临床用药量,将丹红注射液作用浓度按0,2,4,8μL·mL-1分组,每孔2 mL,以0μL·mL-1为阴性对照组。药物共同作用3 d后,进行以下指标观察。

1.3 细胞凋亡形态观察及细胞凋亡指数的测定 细胞按每孔2×105个接种于6孔板中,待细胞贴壁后,根据预实验及临床用药量,将丹红注射液作用浓度按0, 2,4,8μL·mL-1分组,加药作用3 d后在显微镜下观察,摄相。每孔2 mL,以0μL·mL-1为阴性对照组,其后以2μL·m L-1作用肝癌细胞,分别于0,6,12,24 h收集细胞,流式细胞仪检测各时间点细胞的凋亡指数。

1.4 噻唑蓝法检测丹红注射液对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用 取处于对数生长期的SMMC-7721细胞,按每孔5×103个接种于96孔板,分别于铺板第1, 2,3天时每孔加入5 mg·mL-1噻唑蓝溶液10μL,置于细胞培养箱中作用4 h,然后每孔加入10%十二烷基苯磺酸钠-盐酸溶液100μL以溶解细胞内形成的蓝紫色结晶体,作用3～6 h。第4天时酶标仪570 nm处测定吸光度(A570)值,每个时间设3个复孔。按以下公式计算促进/抑制率:细胞增殖促进/抑制率(%)= (1-实验组A570值/对照组A570值)×100%

1.5 膜联蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染检测细胞凋亡 用0.25%不含依地酸二钠的胰蛋白酶溶液消化各组细胞,制成单细胞悬液后移入1.5 mL离心管中,2 000 r·min-1(r=8 cm)离心5 min；加入磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞沉淀2次,收集(1～5)×105个细胞；加入重悬细胞结合缓冲液500μL；加入Annexin V-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)溶液5μL混匀,加入PI溶液5μL,混匀,室温,避光反应15 min；1 h内进行流式细胞仪检测,激发波长488 nm,发射波长530 nm。

1.6 逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptasepolymerase chain recation,RT-PCR)检测凋亡相关基因在SMMC-7721细胞中的表达

1.6.1 总RNA的抽提 用胰酶消化收集各组细胞(各约106个)于无菌的1.5 mL离心管中；用磷酸盐缓冲溶液洗涤一次细胞后加入Trizol试剂1 mL,剧烈振荡至细胞沉淀充分溶解消失；加入三氯甲烷溶液200μL,剧烈颠倒20次,充分混匀,放置5 min,4℃、12 000×g离心15 min；弃去上清液,干燥,加焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)溶液20～50μL溶解沉淀。

1.6.2 RT-PCR反应 用逆转录反应体系20μL合成cDNA,以所得到的cDNA作为模板,进行PCR扩增。取PCR产物和DNA Marker各5μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统观察电泳结果。

p53:上游引物5′-TTG GAT CCA TGT TTT GCC AAC TGG CC-3′

下游引物5′-TTG AAT TCA GGC TCC CCT TTC TTG CG-3′

Bcl-2:上游引物5′-TGT GGC CTT CTT TGA ATT CG-3′

下游引物5′-CTA CCC AGC CTC CGT TAT CC-3′

Bax:上游引物5′-GGA TGCGTCCAC CAA GAA-3′

下游引物5′-GCA CTC CCG CCA CAA AGA-3′

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH):上游引物5′-TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA-3′

下游引物5′-TCC TTG GAG GCC ATG TGG GCC AT-3′

2 结果

2.1 丹红注射液对SMMC-7721细胞形态的影响及细胞凋亡指数的测定

2.1.1 丹红注射液对SMMC-7721细胞形态的影响SMMC-7721细胞按不同加药浓度进行培养,倒置显微镜下观察。对照组细胞密度高,体积规则呈正常梭形,正常细胞98%,凋亡细胞2%。随着药物浓度的增大,凋亡细胞明显增多,细胞由梭形变成圆形,皱缩、部分细胞从瓶壁脱落,悬浮在培养液中。随加药剂量增大,细胞脱落增加。2μL·m L-1剂量组开始出现凋亡状态,8μL·m L-1剂量组细胞基本脱落死亡(图1)。

2.1.2 细胞凋亡指数的测定 凋亡指数为凋亡细胞所占测定细胞总数的百分率,选用2μL·mL-1丹红注射液进一步观察,以0 h未加药时为对照组,6及12 h时肝癌细胞凋亡指数较对照组逐渐增加(图2),作用24 h后细胞凋亡指数与对照组0 h比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 丹红注射液对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用

不同浓度的丹红注射液分别给药24,48,72 h后,对SMMC-7721细胞的生长呈明显抑制作用(图3)。结果表明细胞增殖的抑制率与药物浓度及作用时间密切相关,单因素方差分析结果表明不同药物浓度与对照组间细胞抑制率差异有统计学意义(P＜0.05),随着药物浓度和作用时间的增加,对细胞增殖的抑制作用越明显。

2.3 丹红注射液诱导SMMC-7721细胞凋亡的作用SMMC-7721细胞经不同组别处理,PI染色后使用流式细胞仪进行监测分析。结果表明:丹红注射液可以诱导细胞凋亡,随给药时间的增加诱导细胞凋亡的作用逐渐增强。对照组凋亡比例为7.63%,给药后的细胞凋亡比例升高,2,4,8μL·mL-1丹红注射液组细胞凋亡比例分别为8.28%,12.35%,33.86%,与对照组比较均差异有统计学意义(均P＜0.05)。细胞凋亡比例随药物浓度增大而逐渐增大(图4,5)。

2.4 RT-PCR检测细胞中凋亡相关基因的表达 抗凋亡基因Bcl-2与促凋亡基因Bax是Bcl-2家族成员,二者比例决定了细胞对凋亡信号的反应。RT-PCR法检测促凋亡基因Bax、p53和抗凋亡基因Bcl-2转录情况。与对照组相比,丹红注射液组促凋亡基因Bax mRNA和p53 mRNA表达量随着加药剂量的升高而增强；抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达量随着加药剂量的升高而下降(图6)。利用Bandscan软件扫描半定量分析条带的灰度值,结果见图7,与对照组相比,促凋亡基因Bax和p53 mRNA相对表达量相对增加(P＜0.05)；抗凋亡基因Bcl-2相对表达量降低(P＜0.05)。

A.对照组;B.2μL·mL-1丹红注射液组;C.4μL·mL-1丹红注射液组;D.8μL·mL-1丹红注射液组图1 4组细胞形态观察(40×10)A.the control group；B.2μL·mL-1danhong injection group；C.4μL·mL-1danhong injection group；D.8μL·mL-1danhong Injection groupFig.1 Morphology of four groups of cells(40×10)

图2 2μL·m L-1丹红注射液处理SMMC-7721细胞24 h细胞凋亡指数的变化Fig.2 Apoptosis index of SMMC-7721 cells after treatment w ith 2μL·m L-1danhong injection for 24 h

图3 丹红注射液对SMMC-7721细胞生长的作用Fig.3 Effect of danhong injection on the grow th of hepatoma cells

3 讨论

肿瘤是在遗传基础上多种致瘤因素作用的结果,细胞失去了正常分化的能力,异常增殖形成新生物,丧失了正常的生理功能。恶性肿瘤具有局部浸润和远处转移的特性。本研究显示,丹红注射液作用后,SMMC-7721细胞一部分发生凋亡,且具有时间和剂量依赖性,随着药物剂量的增加,细胞的凋亡率增大。经典的细胞凋亡途径包括受体介导途径和线粒体介导途径。线粒体介导的细胞凋亡途径通过Bcl-2家族调节。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白[2-3]。抗凋亡蛋白Bc1-2与促凋亡蛋白Bax的比例,即Bcl-2/Bax异源二聚体与Bax/Bax同源二聚体的比例,决定了细胞对凋亡信号的反应,即生存还是死亡[4]。Bax是一种很重要的促凋亡基因,其表达产物常以Bax/Bax同源二聚体形成来诱导细胞凋亡,起到加速细胞凋亡的作用。

A.对照组;B.2μL·mL-1丹红注射液组;C.4μL·mL-1丹红注射液组;D.8μL·mL-1丹红注射液组图4 4组细胞的凋亡图A.the control group；B.2μL·mL-1danhong injection group；C.4μL·mL-1danhong injection group；D.8μL·mL-1danhong injection groupFig.4 Apoptosis of fou r groups of cells

A.对照组;B.2μL·mL-1丹红注射液组;C.4μL·mL-1丹红注射液组;D.8μL·m L-1丹红注射液组图5 4组细胞的凋亡指数比较A.the control group；B.2μL·mL-1danhong injection group；C.4μL·mL-1danhong injection group；D.8μL·mL-1danhong injection groupFig.5 Comparison of the apoptosis index am ong 4 groups of cells

A.对照组;B.2μL·mL-1丹红注射液组;C.4μL·mL-1丹红注射液组;D.8μL·m L-1丹红注射液组图6 4组细胞凋亡相关基因的mRNA转录水平A.the control group；B.2μL·mL-1danhong injection group；C.4μL·m L-1danhong injection group；D.8μL·mL-1danhong injection groupFig.6 mRNA transcription levels of apoptosis related gene in four groups of cells

图7 Bax、p53和Bcl-2在4组细胞株中的mRNA表达Fig.7 mRNA expression of Bax,p53 and Bcl-2 in four groups of cells

笔者采用RT-PCR法检测了凋亡相关基因的变化,结果表明促凋亡基因Bax和p53表达上调,抗凋亡基因Bcl-2表达下调,故其Bax/Bcl-2明显升高,提示丹红注射液抗凋亡可能是通过上调Bax表达和下调Bcl-2表达实现的。但目前其作用机制尚不明确,有待于进一步研究。肿瘤的发生和发展不仅与细胞的分化异常及增殖过度有关,而且与细胞凋亡的减少密切相关,而一旦细胞增殖与凋亡失控,则可导致肿瘤的发生[5]。本研究将结果显示,丹红注射液能抑制肝癌的生长,并能诱导其凋亡,这为传统中药用于肿瘤治疗开拓了新的思路。

[1] 郑谨,刘强,史恒军,等.丹红注射液促肝癌细胞凋亡及NDRG2表达的初步研究[J].山西医科大学学报,2010, 41(12):1009-1010.

[2] 李敏,谷俊侠,杨慧翠,等.RMP在γ射线诱导的肝癌细胞凋亡中的表达[J].苏州大学学报:医学版,2009,50 (1):21-23.

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DOI 10.3870/yydb.2014.05.004

Pro-Apoptosis Effects of Danhong Injection on the SMMC-7721 Hepatoma Cells

ZHONG Lei,XU Li-ping,QIAN Xian-zhong,JIN Hui-jing,CHEN Chao,WU Li-jun
(Department of Pharmacy and Apparatus,the 100thHospital of PLA,Suzhou 215007,China)

ObjectiveTo investigate the effects ofdanhonginjection on theapoptosis of SMMC-7721 heptoma cells.MethodsThe hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 was incubated with different concentrations(0,2,4,8μL·mL-1) ofdanhonginjection,and cellmorphology was studied under themicroscope.The apoptosis index was detected by flow cytometry at 0,6,12,24 h after cultured with 2μL·m L-1danhonginjection.Cell proliferation was measured by MTT assay;Gene expressions of p53,Bax and Bcl-2 were detected by RT-PCR at different drug concentrations.ResultsThemorphology of the hepatoma cells changed obviously,and the apoptosis index increased bydanhonginjection in a dose-dependant manner.Thedanhonginjection decreased gene expressions of Bcl-2,and obviously increased p53 and Bax.ConclusionDanhonginjection can dose-and time-dependently promote apoptosis of SMMC-7721 cells.

Danhonginjection;SMMC-7721 hepatoma cells;Apoptosis

R286;R979.1

A

1004-0781(2014)05-0565-04

2013-03-22

2013-05-07

仲蕾(1987-),女,江苏苏州人,硕士,研究方向:药理学。电话:(0)18629057786,E-mail:zhongleiqin@126.com。

仵利军(1978-),男,浙江湖州人,主管药师,研究方向:药事管理学。电话:(0)15195607766,E-mail:410385634@qq.com。